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문제 정의
- 본 실험에서는 객관적인 효능 검증을 통하여 임상 활용 근거를 제시하고 효과적인 의학적 치료 영역 확대를 위한 기초적 자료를 제공하고자 荊芥蓮翹湯(HYT)을 시료로 면역 세포 및 이와 관련된 면역 반응 유발 물질들에 미치는 영향을 조사하였다.
- 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 荊芥連翹湯(HYT)의 피부염 개선효과를 객관적으로 검증하기 위하여 다양한 면역 관련 인자에 미치는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5). 이는 본 시료인 HYT가 피부로 침윤되는 면역세포들 중에서 호산구와 과립구의 침윤28,29)을 억제시킴으로써 아토피 피부염에 효과적으로 작용함을 추측케 한다.
- 이에 저자는 현재 임상에서 피부과 질환에 사용되고 있는 荊芥蓮翹湯(HYT)의 아토피 피부염 개선 효과를 객관적으로 증명하고 이를 기초적 자료로 제공하고자 in vivo 실험동물 모델인 NC/Nga 생쥐에 인간병증과 유사한 AD 병태를 유발하여 피부염 지수, DLN과 배부피부 내 면역 세포, 혈액 내 사이토카인 및 혈청 내 면역글로불린에 미치는 영향 등을 검색하였다.
- 혈액 내 면역세포에 미치는 영향을 살펴보고자 PBMC 내 면역 세포의 비율을 조사하였다. B 세포를 나타내는 CD19+30) 세포의 비율이 대조군에 비해 10.
제안 방법
- 제모가 끝나면 VEET 제모크림 100 ㎎을 동일한 부위에 도포하여 등 부위 남은 잔털을 깨끗이 제거하고 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 4% SDS 용액 150 ㎍를 스프레이 하고 2~3시간 정도 완전히 건조시킨 후 Biostir AD 연고 100 ㎎를 도포하였으며, 주 2회씩 3주 동안 총 6회 시행하였다.
- 6주간의 약물 투여후 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법으로 관능 평가를 실시하였다. 평가 항목은 홍반 (Erythema), 가려움과 건조 피부 (Pruritus & Dry skin), 부종과 혈종 (Edema & Hematoma), 짓무름(Excoriation), 태선화 (Lichenification)로 5가지이다.
- IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, RANTES 농도는 ELISA kit를 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
- IgE 생성량의 측정은 ELISA kit를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 항체를 coating 완충 용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 4℃에서 overnight 하였다.
- 04% trypan blue로 염색하여 count 하였다. PBMC는 심장 채혈 후 ACK 용액을 넣어 적혈구를 용해시키고 2번 세척한 후 cell strainer를 통과 시켜 얻은 세포를 유세포 분석에 사용하였다.
- cells/㎖의 농도로 조정한 후 4℃에서 면역형광염색을 실시하였다. 각각에 anti-CD3-PE, anti-CD69-FITC, anti-NKT -FITC, anti-B220-PE, anti-IgE-FITC, antiCCR3-PE, anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE을 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세하고 flow cytometry를 이용하여 분석하였다.
- 각각에 anti-CD3-PE, anti-CD69-FITC, anti-NKT -FITC, anti-B220-PE, anti-IgE-FITC, antiCCR3-PE, anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE을 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세하고 flow cytometry를 이용하여 분석하였다.
- 실험 종료 후 Biostir AD로 유발된 NC/Nga 생쥐에서 배부 일정량의 피부 조직을 잘게 chopping 한 후 collagenase 1 ㎎/㎖ (in 2% FBS + RPMI 1640)을 넣고 37℃ shaker (140 rpm, 20min.) 배양기에서 배양하여 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이들 세포들에 ACK 용액 (8.
- 실험 종료 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 6,500 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, RANTES 농도는 ELISA kit를 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
- 실험군은 9주령부터 HYT 를 8.9㎎/day의 농도로 6주간 경구 투여하였으며, 대조군은 증류수를 실험군과 동일한 양으로 경구 투여하였다.
- 아토피 피부염을 일으키는 중요한 면역조절 물질인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, RANTES를 혈청에서 측정하여 HYT가 사이토카인 발현에 미치는 영향을 알아보았다.
- ) 배양기에서 배양하여 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이들 세포들에 ACK 용액 (8.3 g NH4Cl, 1 g KHCO3 in 1L of demineralized water + 0.1 mM EDTA)을 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 D-PBS로 2회 세척한 후 cell strainer를 통과 시킨 세포를 0.04% trypan blue로 염색하여 count 하였다. PBMC는 심장 채혈 후 ACK 용액을 넣어 적혈구를 용해시키고 2번 세척한 후 cell strainer를 통과 시켜 얻은 세포를 유세포 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 8 주령 NC/Nga 생쥐를 ether로 마취시킨 후 등 부위 및 목 뒷부분을 제모하였다. 제모가 끝나면 VEET 제모크림 100 ㎎을 동일한 부위에 도포하여 등 부위 남은 잔털을 깨끗이 제거하고 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 열탕추출기 (대웅, Korea), 감압 증류장치 (Rotary evaporator, Büchi B-480, Switzerland), microwave oven (LG, Korea), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., USA), clean bench (Vision scientific, Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), water bath (Vision scientific Co., Korea), plate shaker (Lab-line Co., USA), vortex mixer, heating block (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue Co., Japan), centrifuge (한일, Korea), deep -freezer (Sanyo Co., Japan), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), flow cytometer (Becton Dickinson, USA), Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA), ELISA reader (Molecular Devices, Co., USA) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약 중 collagenase, trypsin-EDTA, acetic acid, tris-base, tris-HCl, paraformaldehyde, dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) 등은 Sigma사 (USA) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사(USA) 제품을, DMEM은 Gibco사 (USA) 제품을, Biostir AD는 Biostir사 (Japan) 제품을, anti-CD3-PE, anti-CD69-FITC, anti-NKTFITC, anti-B220-PE, anti-IgE-FITC, anti-CCR3-PE, anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE 등은 BD-Pharmingen사 (USA) 제품을, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, RANTES ELISA kit는 Biosource사 (USA) 제품을, IgE ELISA kit는 Shibayagi사 (Japan) 제품을 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 荊芥連翹湯(Hyunggaeyunkyotang, 이하 HYT)의 구성 약재들은 대전대학교 부속한방병원에서 구입하여 정선 후 사용하였고, 그 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다 (Table 1).
- 실험동물인 수컷 7주령의 NC/Nga 생쥐는 중앙실험동물에서 공급 받아 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co., korea)와 물을 충분히 공급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***p<0.001).
- Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**p<0.01).
- Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*p<0.05).
- The results represNC/Nthe mcen ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (++p<0.01).
- The results represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (+++p<0.001).
- The results represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (++p<0.01).
- The results represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (+p<0.05).
- The results represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculatedby compared with normal group by student's t-test (++p<0.01).
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error (S.E.)로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's t-test 분석법을 이용하여 결정하였다.
성능/효과
- 1. HYT 투여군은 대조군에 비하여 육안적으로 아토피 피부염을 개선시켰으며, 14주에는 피부염 지수를 유의성 있게 감소시켰다.
- 2. HYT 투여군은 대조군에 비하여 배부피부 내 CCR3+, B220+/IgE+, Gr-1+/CD11b+ 면역세포 비율을 각각 40.5%, 34.2%, 48.1%로 유의성 있게 감소시켰다.
- 3. HYT 투여군은 대조군에 비하여 PBMC 내 CD19+ 면역세포 비율을 10.8% 증가시켰고, CD3+, CD3+/CD69+, NKT+ 면역 세포비율을 각각 5.3%, 35.2%, 44.9% 감소시켰다.
- 4. HYT 투여군은 대조군에 비하여 혈청 내 IFN-γ의 발현을 589.3% 증가시켰고, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, MCP-1 및 RANTES의 발현을 각각 31.4%, 82.1%, 97.1%, 39.5%, 83.7%, 26.1%, 48.6% 감소시켰으며, IgE의 발현 또한 47.2% 감소시켰다.
- 혈액 내 면역세포에 미치는 영향을 살펴보고자 PBMC 내 면역 세포의 비율을 조사하였다. B 세포를 나타내는 CD19+30) 세포의 비율이 대조군에 비해 10.8% 증가하였고 (Fig. 6), T 세포를 나타내는 CD3+31)는 5.3% 감소하였으며 (Fig. 7), 활성화 T 세포를 나타내는 CD3+/CD69+32) 세포 또한 대조군에 비하여 35.2% 정도 감소하였다 (Fig. 8).
- Fig. 1 은 10주부터 14주까지 2주 간격으로 대조군, HYT 투여군의 피부염 유발 정도와 개선 정도를 나타내주는 사진으로, 최종 14주에는 HYT 투여군이 대조군에 비해서 피부염이 개선되었음을 확인할 수 있다 (Fig. 1). 피부염 지수는 아토피 피부염을 유발한 후 10주, 12주, 14주때 관능적 방법에 의하여 측정한 결과 시간이 경과할수록 피부염지수가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하여, 14주째 대조군은 7.
- . HYT가 NKT+ 세포 비율에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조군에 비하여 44.9% 정도 유의성 있는 감소를 보였다(Fig. 9). 이 결과들은, DLN에서의 결과와 마찬가지로 HYT가 혈액 내에서도 세포간의 균형을 유지시켜주고 염증성 사이토카인을 분비하는 세포의 활성화를 억제하는 기전이 있음을 입증해 주고 있다.
- 1). SCORD 법을 이용한 피부염 지수에서도 육안으로 관찰된 결과와 마찬가지로 대조군의 7.0에 비해 HYT 투여군은 3.5로 유의적인 감소를 보였다 (Fig. 2).
- 먼저 Biostar AD 연고를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 NC/Nga 생쥐의 피부염 유발 정도를 육안으로 살펴본 결과, HYT 투여군이 대조군에 비해 투여 기간 증가와 비례하여 현저한 피부 개선 효과를 보였다 (Fig. 1). SCORD 법을 이용한 피부염 지수에서도 육안으로 관찰된 결과와 마찬가지로 대조군의 7.
- 먼저, IL-4, IL-5, IL-13의 발현은 정상군의 수치와 비교하여 대조군에서 50% 이상 증가한 반면, HYT 투여군은 대조군과 비교하여 31.4%, 82.1%, 39.5% 정도 감소하였고 (Fig. 10, 11, 13), IL-6는 대조군과 비교하여 97.1%의 현저한 감소를 보였으며 (Fig. 12), TNF-α 역시 대조군과 비교하여 83.7% 정도 유의적인 감소를 보였다 (Fig. 14).
- 배부 피부 내 면역 세포 변화에서는, 호산구를 나타내는 CCR3+28) 세포의 비율이 대조군에 비해 40.5% 감소하였고 (Fig. 3), B세포에서의 IgE 생성도 대조군에 비해 34.2% 감소하였으며 (Fig. 4), 과립세포를 나타내는 Gr-1+/CD11b+29) 세포에서도 대조군에 비해 48.1% 감소한 것으로 나타났다 (Fig. 5). 이는 본 시료인 HYT가 피부로 침윤되는 면역세포들 중에서 호산구와 과립구의 침윤28,29)을 억제시킴으로써 아토피 피부염에 효과적으로 작용함을 추측케 한다.
- 9). 이 결과들은, DLN에서의 결과와 마찬가지로 HYT가 혈액 내에서도 세포간의 균형을 유지시켜주고 염증성 사이토카인을 분비하는 세포의 활성화를 억제하는 기전이 있음을 입증해 주고 있다.
- 이상의 결과로 보아 HYT가 아토피 피부염이 유발된 NC/Nga 생쥐에서 나타나는 피부염 개선 효과는 주로 염증세포의 활성화 억제와 면역조절 물질인 사이토카인, 케모카인의 발현 감소를 통하여 호산구의 분화 및 피부로의 침윤을 억제함으로써 임상 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 정상군이 0.35 ± 0.06 (pg/㎖), 대조군은 7.73 ±1.46 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (+++p<0.001) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 1.38 ± 0.19 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (***p<0.001) 감소하였다 (Fig. 11).
- 정상군이 1.10 ± 0.20 (%), 대조군은 3.45 ±0.15 (%)로 나타나 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있게 (+p<0.05) 증가하였고, HYT 투여군은 1.90 ± 0.10 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 9).
- 정상군이 2.15 ± 0.35 (%), 대조군은 3.95 ±0.21 (%)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (+p<0.05) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 2.60 ± 0.14 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 4).
- 정상군이 2.95 ± 0.21 (%), 대조군은 10.50 ±0.28 (%)로 나타나 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 5.45 ± 0.35 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 5).
- 정상군이 24.37 ± 1.10 (pg/㎖), 대조군은 74.85 ± 4.91 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 51.36 ± 3.88 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (*p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 10).
- 정상군이 3.95 ± 0.35 (%), 대조군은 12.35 ±0.49 (%)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 7.35 ± 0.07 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 3).
- 정상군이 39.63 ± 0.72 (pg/㎖), 대조군은 88.65 ± 7.11 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (+p<0.05) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 65.51 ± 0.00 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 16).
- 정상군이 391.22 ± 23.62 (pg/㎖), 대조군은 785.51 ± 13.61 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 475.05 ± 4.84 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 13).
- 정상군이 40.36 ± 2.02 (pg/㎖), 대조군은 82.83 ± 3.02 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 42.57 ± 0.22 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 17).
- 정상군이 5.25 ± 0.21 (%), 대조군은 12.35 ±0.49 (%)로 나타나 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있게 (++p<0.01) 증가하였고, HYT 투여군은 8.00 ± 0.28 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (**p<0.01) 감소하였다 (Fig. 8).
- 정상군이 59.6 ± 9.7 (ug/㎖), 대조군은 224.5± 10.5 (ug/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 118.5 ± 18.0 (ug/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (*p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 18).
- 정상군이 6.08 ± 0.62 (pg/㎖), 대조군은 329.44 ± 64.97 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (+++p<0.001) 증가를 나타내었고, HYT 투여군은 9.56 ± 0.42 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (***p<0.001) 감소하였다 (Fig. 12).
- 정상군이 71.15 ± 0.92 (%), 대조군은 76.80± 0.57 (%)로 나타나 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있게 (+p<0.05) 증가하였고, HYT 투여군은 72.75 ± 0.35 (%)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 감소하였다 (Fig. 7).
- 정상군이 8.34 ± 0.25 (pg/㎖), 대조군은 0.56± 0.29 (pg/㎖)로 나타나 정상군에 비하여 유의성 있는 (++p<0.01) 감소를 나타내었고, HYT 투여군은 3.81 ± 0.52 (pg/㎖)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (*p<0.05) 증가하였다 (Fig. 15).
- 피부염 지수는 아토피 피부염을 유발한 후 10주, 12주, 14주때 관능적 방법에 의하여 측정한 결과 시간이 경과할수록 피부염지수가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하여, 14주째 대조군은 7.00 ± 1.26, HYT 투여군은 3.50 ± 1.38로 유의성 있는 (**p<0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 2).
후속연구
- 이상의 결과로 보아 임상에서 활용되고 있는荊芥連翹湯(HYT)의 아토피 피부염의 개선 효과가 실험적으로 규명됨으로써 지속적인 임상 활용이 기대된다. 아울러 향 후 荊芥連翹湯과 관련된 연구에 있어 기초적 자료를 제공할 수 있을 것으로 사료되며, 변증시치에 의한 보다 효과적인 처방 개발을 위해서는 구성 약물 혹은 구성 약물간 효능 평가에 대한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 임상에서 활용되고 있는荊芥連翹湯(HYT)의 아토피 피부염의 개선 효과가 실험적으로 규명됨으로써 지속적인 임상 활용이 기대된다. 아울러 향 후 荊芥連翹湯과 관련된 연구에 있어 기초적 자료를 제공할 수 있을 것으로 사료되며, 변증시치에 의한 보다 효과적인 처방 개발을 위해서는 구성 약물 혹은 구성 약물간 효능 평가에 대한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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