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문제 정의
- 단호박의 농도별, 발효시간별로 관능적 차이가 있는지 검사를 하였다. 이 실험은 어느 농도와 어느 발효 시간이 가장 좋은 것인지 판단한 실험은 아니므로 차후 기호도 또는 선호도 검사가 진행되어야 할 것이다.
- 그러나 호박분말 첨가가 아닌 단호박 자체를 기질로 사용한 발효음료나 유산균을 김치에서 분리하여 사용한 발효음료는 개발이 되어 있지않다. 따라서 본 연구는 단호박의 소비 수요를 증가시키고 단호박의 식품 영양학적 가치를 그대로 가진 새로운 유산균 발효 음료를 개발하고자 한다.
가설 설정
- pH 값의 측정은 pH-meter를 사용하여 측정하였고 적정산도는 단호박 발효배지 중 17.6 业를 덜어낸 다음 증류수 17.6 戒를 더하여 총 볼륨 35.2 I戒를 만든 후 phenolphthalein용액을 2~3적 가하였다. 0.
제안 방법
- fall sequencing을 하였다. 16s rRNA full sequencing을 한 결과를 rRNA database (NCBI : national center for biotechnology information, RDP : ribosomal database project, ERRD : European ribosomal RNA database)와 비교하여 대상 미생물이 어떤 종류의 미생물이 분리 되었는지 확인하였다
- 김치유래 유산균 단호박 발효음료의 개발을 위해 김치에서 유산균 19종을 분리하였다. 이후 진행된 인공 위액 및 인공 담즙산 실험에서 살아남은 유산균 1종을 선별하였고 이를 C332라 명명하였다.
- 단호박 배지를 농도별로 10, 20, 30%를 만들어 발효시켰다. 무게는 wet weight를 이용하여 구하였다.
- 단호박 배지를 호기적과 혐기적으로 배양시켜 둘을 비교해보았다(Fig. 1, Fig. 2). 호기적 배양보다 혐기적 배양에서 초기균체의 성장속도나 최종 밀도에서 더 높은 수치를 나타냈으나 수치적 차이는 미미하였다.
- 대장균에 대한 항균성은 실험을 통해 확인하였다. 대장에서 대장균제어는 유산균의 중요한 역할이므로 장 건강유지에 유용한 발표음료가 될 수 있을 것이며, 저장성 또한 우수할 것이다
- 동정된 균주들 중 활성이 가장 좋은 균주를 취하여 16s rRNA fall sequencing을 하였다. 16s rRNA full sequencing을 한 결과를 rRNA database (NCBI : national center for biotechnology information, RDP : ribosomal database project, ERRD : European ribosomal RNA database)와 비교하여 대상 미생물이 어떤 종류의 미생물이 분리 되었는지 확인하였다
- 발효가 끝난 단호박 음료를 밀폐 시킨 후 4℃의 냉장고에 보관하여 3일 간격으로 생균수와 pH 그리고 산도를 측정하였다. 이상의 모든 측정치는 3회 반복 실시하여 평균값으로 하였다.
- 무게는 wet weight를 이용하여 구하였다. 발효시간 별로는 12, 24, 36, 48시간동안 발효를 시켰다. 이렇게 만들어진 발효음료는 15℃로 냉각하여 5점 평점법 (매우 좋음 5점, 좋음 4점, 보통 3점, 나쁨 2점, 매우 나쁨 1점)으로 평가하였다.
- 대조군으로 사용하기 위하여 분리된 유산균을 단호박 50 ml broth 배지에 접종하고 CO2 가스를 주입하지 않았다. 변화를 관찰하기 위하여 광밀도 (optical density)와 glucose 량, pH를 분석하였다. 광밀도는 660 nm에서 측정하였으며 glucose는 Glucose kit를 사용하여 즉정하였다.
- 본 연구는 단호박 발효 음료이기에 이제 단호박 배지를 이용하여 실험을 하였다. 앞에서 내산성과 담즙내성 균주를 분리한 유산균을 이용하여 단호박 배지에 접종하였다.
- 실험을 하였다. 앞에서 내산성과 담즙내성 균주를 분리한 유산균을 이용하여 단호박 배지에 접종하였다.
- 약 18시간 배양 후 대장균에 대한 저해성을 확인하였다. 유산균이 최종적으로 머무를 곳은 사람의 대장이다.
- 위 실험을 통하여 최종적으로 분리된 균 C332에 대한 16r RNA Full Sequencing을 하여 균주 동정을 실시하였다. 그 결과 C332는 Lactobacillus plantarum의 확률이 99%로 동정되었다(Fig.
- 5 叫를 도말 한 후 36℃ 의 배양기에서 48시간 배양하였다. 이후 콜로니를 계수하여 희석배수를 곱하여 1 ml중의 생균수를 측정하였다.
- 가스를 주입하였다. 이후 플라스크를 마개로 막은 후 CO2 배양기에서 1일간 배양하며, 2시간별로 관찰하였다. 대조군으로 사용하기 위하여 분리된 유산균을 단호박 50 ml broth 배지에 접종하고 CO2 가스를 주입하지 않았다.
- 김치에서 분리된 유산균을 36 ℃ MRS broth에서 24시간 배양시킨 후 15 ml tube에 넣고 3, 000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다. 회수된 균에 상등약과 동일한 양의 인공위액을 넣은 후 36℃ shaking incubator에서 2시간 배양한 후 IO, 배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 ml 도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다 대조군은 pepsin을 첨가하지 않고 pH를 맞추지 않은 broth 를 이용 하였다. 대조군의 희석은 1(尸배를 하였다
- 김치에서 분리된 유산균을 36℃ MRS broth에서 24시간 배양시킨 후 15 ml tube에 넣고 3, 000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다. 회수된 균은 인공위액을 상등액 만큼 넣어 36 ℃ shaking incubator에서 2시간 배양한 후 1(尸배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 ml 도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다. 대조군은 10%의 oxgall을 넣지 않은 broth를 사용하였다 대조군의 희석은 10"배를 하였다.
대상 데이터
- 유의성 검정은 패널과 시료별로 점수의 합계를 계산한 뒤 분산분석 방법으로 하였다. 관능평가 요원은 의사소통이 가능하고, 단마 신맛, 짠맛 쓴맛과 향을 구분 할 줄 아는 대학생 및 대학원생 13명으로 구성하였다.
- 국내산 단호박은 신토자 품종으로 2007년 10월에 경기도 양평에서 수확된 것으로 서울 경동시장에서 구입하였다. 단호박은 구입 후 분리 및 세절하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 보관하면서 사용하였다.
- 종 균냉동보관은 이ycerol을 처리하여 -80℃ 에서 3개월마다 계대하였다. 균은 인공위액과 인공담즙산에서 살아남은 1종을 최종적으로 실험에 사용하였고, 이는 C332라 명명하였다.
- 김치에서 유산균으로 추정되는 균주 19종을 분리 하였다. 이들을 배양하며 발효물의 pH가 pH 4를 넘어가는 균들은 실험에서 제외하여 총 3종을 분리하였다.
- 단호박은 구입 후 분리 및 세절하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 보관하면서 사용하였다. 배지 제조는 과피 부분과 과육 그리고 씨 부분으로 나누었으며 과피 및 과육을 잘게 썰고 (1cm이하) 씨는 반으로 잘라 플라스크에 넣은 후 60℃ 에서 1시간 중탕하였다.
- 5 ml 도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다 대조군은 pepsin을 첨가하지 않고 pH를 맞추지 않은 broth 를 이용 하였다. 대조군의 희석은 1(尸배를 하였다
- 본 연구는 단호박 발효 음료이기에 이제 단호박 배지를 이용하여 실험을 하였다. 앞에서 내산성과 담즙내성 균주를 분리한 유산균을 이용하여 단호박 배지에 접종하였다.
- 유산균을 건강음료로 사용하기 위해서는 유산균이 대부분 죽는 위에서 위산을 견딜 수 있는 내산성이 요구되므 최종적으로 선별된 3종 중 생존한 C332를 발표음료제조개발에 사용하였다.
- 담즙산은 유산균을 사멸시키는 또 다른 변수이며 이 담즙산도 통과해야 장에 유산균이 살아서 도달 할 수 있다. 이 실험은 인공위액에서 살아남은 유산균을 가지고 실험 하였다. 10%의 oxgall을 broth 배지에 첨가하여 균을 배양한 후 배양된 균을 1(尸배 희석하여 MRS agar배지에 0.
데이터처리
- 이렇게 만들어진 발효음료는 15℃로 냉각하여 5점 평점법 (매우 좋음 5점, 좋음 4점, 보통 3점, 나쁨 2점, 매우 나쁨 1점)으로 평가하였다. 유의성 검정은 패널과 시료별로 점수의 합계를 계산한 뒤 분산분석 방법으로 하였다. 관능평가 요원은 의사소통이 가능하고, 단마 신맛, 짠맛 쓴맛과 향을 구분 할 줄 아는 대학생 및 대학원생 13명으로 구성하였다.
- 이상의 모든 측정치는 3회 반복 실시하여 평균값으로 하였다.
이론/모형
- 인공위액은 Kobayashi 등의 방법에 따라 1 N HC1 을 사용하여 pH2.5로 조정한 MRS broth에 pepsin 1%를 첨가하여 사용하였다(16). 김치에서 분리된 유산균을 36 ℃ MRS broth에서 24시간 배양시킨 후 15 ml tube에 넣고 3, 000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상등액을 버리고 균을 회수하였다.
성능/효과
- 이 실험은 인공위액에서 살아남은 유산균을 가지고 실험 하였다. 10%의 oxgall을 broth 배지에 첨가하여 균을 배양한 후 배양된 균을 1(尸배 희석하여 MRS agar배지에 0.5 ml도말하여 36℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 측정 하였다 생균수 측정결과 1.486 X 106 CFU/皿개를 셀 수 있었다. 대조군은 인공위액에서 나온 결과를 그대로 사용하였다.
- 최종적으로 선별된 3종 중 2종은 사멸하였고 C332라 명한 1종만이 살아남았다. C332를 IO, 배 희석하여 MRS agar 배지에 0.5 ml도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양한 후 생균 수를 측정 하였다 생균수 측정결과 1.66x105 CFU/M개를 셀 수 있었다. 대조군 배지에서 자란 균은 10"배 희석하여 MRS agar배지에 0.
- 49 X 106 CFU/m£ 만큼의 생균수를 측정하였다. C332를 단호박 배지에서 호기적과 혐기적으로 배양한 결과 광밀도, pH에서 큰차이를 발견하지 못하여 통성혐기성 미생물有을 확인하였고, E.co万에 대한 항균활성 측정결과 14 mm의 클리어존이 생겨나 E.co万에 대한 항균활성을 확인하였다. 발효가 끝난 단호박 배지는 pH가 3.
- 단호박 배지가 MRS배지보다 시작 pH가 더 낮은 것으로 관찰 되었다 이 중 단호박 배지에 CO2가 첨가 된 것은 CO2에 의해 시작 pH가 더 낮아진 것으로 생각된다. MRS에서도 CO2첨가가 약간의 시작 pH 수치 저하가 있었지만, MRS 배지 자체의 완충작용으로 인해 단호박 배지보다는 pH의 변화가 덜 한 것으로 나타났다. MRS배지에서는 미应물이 만들어내는 산으로 인해 pH 4.
- 호기적 배양보다 혐기적 배양에서 초기균체의 성장속도나 최종 밀도에서 더 높은 수치를 나타냈으나 수치적 차이는 미미하였다. 김치에서 분리된 C332의 미생물은 통성혐기성 미생물임을 확인할 수 있었으며 발효음료의 대량 생산적 측면에서 보았을 때 호기적 미생물이 혐기적 미생물보다 배양시 비용이 덜 소요되는 점을 감안할 때, 산업적으로도 유용한 균주로 판단할 수 있다.
- 인공위액 실험이나 인공담즙산 실험이나 대조군으로 사용되는 것은 아무것도 첨가하지 않은 MRS broth를 사용하였기 때문이다. 대조군보다는 생균수가 적지만, 10%의 oxgall배지에서도 C332 유산균이 살아남는 것으로 관찰되었다.
- 생균수는 저장 6일째 되는 날부터 약간의 감소를 보이기 시작했다. 산도는 저장 기간 동안 약간 증가하는 경향을 보였으며, pH도약간 떨어지는 경향을 보였다. 우리나라의 경우 호상요구르트의 총 젖산균 수는 1.
- 실험에서 배제하였다. 실험결과 대장균이 도포된 plate 에서 단호박 배지 발효물을 묻힌 paper disk를 중심으로 지름 14 mm의 클리어존이 생성된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 발효되지 않은 단호박 배지를 묻힌 paper disk에서는 클리어존이 형성되지 않았다.
- 실험을 하였다. 앞에서 내산성과 담즙내성 유산균을 배양한 결과 C332은 통성혐기성임을 확인하였으며, 발효음료의 대량 생산적 측면에서 보았을 때 호기적 미생물이 혐기적 미생물보다 배양시 비용이 덜 소요되는 점을 감안할 때, 산업적으로도 유용한 균주로 판단할 수 있다.
- 발효되지 않은 단호박 배지를 묻힌 paper disk에서는 클리어존이 형성되지 않았다. 이것으로 보아 대장균에 대한 항균활성은 유산균 단호박 배지 발효물의 낮은 pH에 의한 것이라 추측되었다.
- 16s rRNA full sequencing을 통해 C332는 Lactobacillus plantarum으로 동정되었다. 이후 관능검사를 통해 발효 시간별, 농도별로 발효음료가 유의수준 5% 로 유의성이 있음을 검증하였다. 저장성평가를 통해 12일간의 저장기간 중 약간의 산도증가 경향과, 약간의 pH 저하 경향을 확인하였고, 우리나라 호상요구르트의 유산균기준치 (1.
- 유산균 19종을 분리하였다. 이후 진행된 인공 위액 및 인공 담즙산 실험에서 살아남은 유산균 1종을 선별하였고 이를 C332라 명명하였다. 이 C332는 앞으로 진행되는 모든 실험에서 종균으로 사용하였다 C332는 인공 위액에서 1.
- 이후 관능검사를 통해 발효 시간별, 농도별로 발효음료가 유의수준 5% 로 유의성이 있음을 검증하였다. 저장성평가를 통해 12일간의 저장기간 중 약간의 산도증가 경향과, 약간의 pH 저하 경향을 확인하였고, 우리나라 호상요구르트의 유산균기준치 (1.0 X 108 CFU/n粉를 상회하는 생균수 (발효 후경과 12일 1.15 X 108 CFU/M)를 확인하여 저장성이 우수한 것으로 나타났다.
- 최종적으로 선별된 3종 중 2종은 사멸하였고 C332라 명한 1종만이 살아남았다. C332를 IO, 배 희석하여 MRS agar 배지에 0.
- 2). 호기적 배양보다 혐기적 배양에서 초기균체의 성장속도나 최종 밀도에서 더 높은 수치를 나타냈으나 수치적 차이는 미미하였다. 김치에서 분리된 C332의 미생물은 통성혐기성 미생물임을 확인할 수 있었으며 발효음료의 대량 생산적 측면에서 보았을 때 호기적 미생물이 혐기적 미생물보다 배양시 비용이 덜 소요되는 점을 감안할 때, 산업적으로도 유용한 균주로 판단할 수 있다.
후속연구
- 하였다. 이 실험은 어느 농도와 어느 발효 시간이 가장 좋은 것인지 판단한 실험은 아니므로 차후 기호도 또는 선호도 검사가 진행되어야 할 것이다. 결과 및 통계분석에 사용된 수식은 다음과 같다
- 86 이므로 시료의 F값이 기준값보다 크므로 유의수준 5%에서 단호박 발효음료는 농도별 발효시간별로 서로 다른 특성의 차이를 보인다고 볼수가 있다. 정확한 최적 농도와 발효시간별 최적 발효는 기호도 또는 선호도 검사를 차후에 진행해 확인해야 한다.
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