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문제 정의
- 수정란의 동결 보존과 비외과적 수정란이식은 현장 적용을 위해서는 지속적인 연구를 수행해야 할 분야라고 생각이 든다. 따라서 본 연구에서는 돼지 동결 정액의 사용으로 체외수정에 이용되는 효율성과 그리고 동결 방법에 따른 동결 융해 후의 생존성을 조사하여 유전자원 확보의 다양한 방법을 모색하고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 돼지의 체외배양 조건에 따른 난포란의 체외성숙과 발달율, 동결정액과 신선정액을 이용한 체외수정율과 발달율 그리고, 수정란의 동결 방법에 따른 생존성의 효율을 조사하여 다양한 유전자원의 보존 방법을 구명하고자 본 연구를 실시하였다. 체외성숙시에 호르몬의 첨가 유, 무에 따른 난포란의 수정율에서 호르몬의 첨가 그룹은 분할율이 77.
- 8%보다 다소 높은 결과를 나타내어 동결 정액보다는 신선정액에서 난포란의 수정율과 배반포가배까지의 높은 결과를 얻을 수 있었다. 본 연구에서 동결정액을 이용하여 수정에 사용한 이유는 멸종 위험성의 문제를 안고 있는 재래가축의 유전자원 확보의 차원에서 정액을 안전하게 보존하여 생물의 유전적 다양성을 확보해 나가는 방법으로서 동결 정액의 효율성을 조사하고자 본 실험을 실시하였다. 동결 정액에서의 수정율이 저조한 이유로서는 Bamba와 Cran(1988)은 정액의 동결시 glycerol이 돼지의 정자의 활력과 정상첨체의 비율이 감소와 함께 이ycerol의화학적 독성이나 금속 융해시의 삼투압 충격 때문이라고 하였다.
제안 방법
- 3 ℃/분 속도로 냉각시킨 후 -35℃에 도달하였을 때 액체질소에 바로 침지하였다. 동결 - 보존 후 수정란을 2주 정도 보관 후에 생존성을 확인하기 위하여 스트로우를 보관고로부터 꺼내어 공기 중에서 약 10초 동안 그리고 37'C의 항온 수조에서 약 20초간 융해 후 TL-HEPES 배양액에서 2~3회 세척 후 체외배양액으로 옮겨 24시간 이상 배양하여 배반포기배의 재형성과 확장 배반포기배 및 부화 단계까지의 발달로서 생존율을 확인하였다.
- 정자의 희석과 동결 방법은 김 등(2002)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지 체외수정을 2.5 mM caffeine과 0.1% BSA가 첨가된 mTBM에서이루어졌다n 44시간 동안 체외성숙된 돼지 난포란은 0.1% Hyalurosidase(Sigma)가 함유된 D-PBS 용액에 넣어 난구 세포를 제거하고 mTBM 용액으로 세정하였다. 세정 후, 15-20 개의 성숙난자는 수정용 mTBM 100 fil 소적에 정자의 최종 농도를 1.
- 돼지수정란의 초자화 동결을 위한 VS1 (vitrification solution 1)용액의 조성은 10% glycerin, 0.1 M glucose, 0.1 M sucrose, 1% polyethylenglycol(PEG)< 혼합하여 사용하였고 VS2는 10% glycerin, 10% ethylene glycol(EG), 0.2 M glucose, 0.2 M sucrose, 2% PEG, 그리고 VS3은 10% glycerin, 30% EG, 0.3 M glucose, 0.3 M sucrose, 3% PEG의 조성으로 동결을 실시하였다. 수정란의 초자화 동결의 평형 시간과 동결 방법은 VS1 용액에서 5분, VS2 용액에서 5분, 그리고 VS3 용액에서 0.
- 3 M sucrose 용액에서 2~3회 세척하고 무혈청 배양액에서 2회 세척 후 배양하였다. 생존성 확인을 위해서 융해 후 16시간 이상 배양하여 평가하였다.
- 1% Hyalurosidase(Sigma)가 함유된 D-PBS 용액에 넣어 난구 세포를 제거하고 mTBM 용액으로 세정하였다. 세정 후, 15-20 개의 성숙난자는 수정용 mTBM 100 fil 소적에 정자의 최종 농도를 1.5 X 105 sperm/ml로 조정하여 미세 소적에 넣어 6시간 동안 38.5℃의 5% CO2 배 양기에서 수정을 유도하였다.
- 5% BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma)를 첨가하여 사용하였다.수정란의 동결을 위해서는 프로그램화된 자동동결기(CL 863, Cryogenic U.S.A)를 사용하여 동결을 실시하였다. 수정란 동결은 0.
- 수정란의 완만 동결을 위한 동결 보호 제로서는 1.8 Methylene glycol(EG, Sigma) 0.25M sucrose를 사용하였으며, 그리고 평형 배양액은 I>PBS(Gibco, U.S.A) 배양액에 0.5% BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma)를 첨가하여 사용하였다.수정란의 동결을 위해서는 프로그램화된 자동동결기(CL 863, Cryogenic U.
- 난소수송은 100 units/ml의 penicillin G 와 100 «g/ml의 streptomycin0] 함유된 36℃ 생리식염수에담아 3시간 내에 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 불필요한 조직을 잘라낸 후 항생제가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척한 후 18 gauge 주사 바늘이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입에 의한 방법(aspiration)으로 난포란을 채취하였다. 채취한 난포란은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS) 에 0.
- 운반된 난소는 불필요한 조직을 잘라낸 후 항생제가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척한 후 18 gauge 주사 바늘이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입에 의한 방법(aspiration)으로 난포란을 채취하였다. 채취한 난포란은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS) 에 0.1% polyvinyl alcohol(PVA)이 첨가된 배양액으로 2희 이상 세척 후 실체 현미경하에서 회수하였다. 회수된 난포란은0.
- 체외배 양 4일째부터는 수정란을 10% Fetal Bovine Serum (FBS)이 함유된 PZM-5 배양액과 혈청이 첨가되지 않은 NCSU 배양액으로 옮겨 배양하였다. 체외발달의 확인은 체외수정 후 2일째에 수정율을 조사하였으며, 7일째에 배반포기배 발달율을 조사하였다.
- 4% BSA 가 함유된 PZM-5과 NCSU-23에서 이루어졌다. 체외수정란은 TL-HEPES 배양액으로 세정한 후 각 well당 500 ”1의 배양액이 들어있는 4-well dish에서 배 양하였다(50개 수정란/500 “1 배양액). 체외배 양 4일째부터는 수정란을 10% Fetal Bovine Serum (FBS)이 함유된 PZM-5 배양액과 혈청이 첨가되지 않은 NCSU 배양액으로 옮겨 배양하였다.
- 1% polyvinyl alcohol(PVA)이 첨가된 배양액으로 2희 이상 세척 후 실체 현미경하에서 회수하였다. 회수된 난포란은0.1% PVA가 함유된 D-PBS로 3~4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급 분류 방법을 따랐다.
대상 데이터
- 등급의 분류는 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급 분류 방법을 따랐다. 난구세포가 4층 이상이고 세포질이 균일한 것은 Grade I, 난구세포가 2~3층인 것은 Grade D, 난구세포가 한 층이거나 나화되었으며, 세포질이 균일한 것은 Grade 山, 전체가나화되었고, 퇴화된 것은 Grade IV로 분류하였으며, 이들 중 Grade I 과 Grade II 의 난포란만을 본 실험에 사용하였다.
- 돼지정액의 채취는 요오크셔 종 수컷 1두에서 주 1회 수압 법에 의하여 채취하였으며, 필터를 부착한 500 ml 보온병에 농후 정액만 분리 채취하였다. 동결정액의 제조는 정액을 채취 즉시 등온의 BTS(Beltsville Thawing Solution) 보존액으로 1:1 희석하여 실험실로 옮겨 22-25℃ 까지 약 2시간에 걸쳐서 서서히 온도를 낮춘다.
- 전체 사용한 수정란은 588개의 난자를 공시하여 실험에 사용하였다. 수정 후 분할율에 있어서는 신선정액이 66.
- 무에 따라서 수정란의 분할율과 배반포기까지의 발달율을 조사한 결과이다. 총 사용된 난자수는 379개의 난자를 이용하였다. 체외성숙 조건에서 호르몬의 첨가는 핵의 성숙뿐만 아니라 세포질의 성숙도 동시에 일어나야 하므로 호르몬의 첨가는 이러한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계학적 분석은 SAS pakage(version 6, 12) 이용과 GLM producer를 사용하여 각 처리구간 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 1% PVA가 함유된 D-PBS로 3~4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착 정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급 분류 방법을 따랐다. 난구세포가 4층 이상이고 세포질이 균일한 것은 Grade I, 난구세포가 2~3층인 것은 Grade D, 난구세포가 한 층이거나 나화되었으며, 세포질이 균일한 것은 Grade 山, 전체가나화되었고, 퇴화된 것은 Grade IV로 분류하였으며, 이들 중 Grade I 과 Grade II 의 난포란만을 본 실험에 사용하였다.
- 그리고 실온에서 15 ml 시험관에 분주하여 1,500 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액은 버리고 정자 펠렛만 회수하여 동결에 사용한다. 정자의 희석과 동결 방법은 김 등(2002)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지 체외수정을 2.
- 25 ml 스트로우에 장착하기까지의 시간은 1분 이내에 완료하여 액체질소에 침지하였다. 초자화로 동결된 수정란의 융해 방법은 Pugh 등(2000)의 방법에 준하여 실시하였다. 즉, 항온 수조의 37℃에서 스트로우를 융해한 후 0.
성능/효과
- 5M ethylene 이y-col로 항동해제로 변경하였을 때는 어떤 발육 단계에서는 생존하지 못하였다. 그러나 본 실험에서는 1.8 M Ethylene을 사용함으로써 다른 동결 보호제보다 독성이 적어 부화 단계까지 수정란이 발달할 수 있었던 것으로 사료된다. 그리고 Nagashi- ma 등(1995b)은 1.
- 05) 높은 발달율을 보였다. 그리고 배반포기로의 발달율에서도 신선 정액이 21.5% 로서 동결 정액의 6.8%보다 다소 높은 결과를 나타내어 동결 정액보다는 신선정액에서 난포란의 수정율과 배반포가배까지의 높은 결과를 얻을 수 있었다. 본 연구에서 동결정액을 이용하여 수정에 사용한 이유는 멸종 위험성의 문제를 안고 있는 재래가축의 유전자원 확보의 차원에서 정액을 안전하게 보존하여 생물의 유전적 다양성을 확보해 나가는 방법으로서 동결 정액의 효율성을 조사하고자 본 실험을 실시하였다.
- 그리고, 항동 해제를 처리를 하여도 돼지 수정란의 생존성이 개선되지 않는 이유는 돼지 수정란에 지질 함량이 높기 때문일 것으로 주측하였다(Niimura와 Ishida, 1980; Toner 등, 1986). 동결 융해후 형태적으로 원래의 수정란으로 되돌아오는 재확장율과 재확장 후 부화 단계까지의 생존성의 조사에서 각 처리 구에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 완만 동결에서의 재획- 장율은 약 10% 수준이며, 초자화 동결 방법에서는 13% 수준으로서 초자화 동결이 다소 높은 재확장율을 보였다.
- 1%)에는 차이가 나타나지 않았다. 돼지 체외수정란의 동결 융해 후 생존성에서는 재확장율과 부화수정란의생존성에서도 두 그룹간의 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 초자화 동결보존 방법에서 다소 높은 경향을 보였다. 결론적으로 돼지 수정란의 생산과 동결 보존 기술의 확립으로 유전자원의 효율적인 보존과 복원을 위해서 체외배양체계와 동결 방법 개선, 그리고 정액의 동결 보존 기술 개발에 보다 많은 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
- 결과이다. 두 처리간의 분할율과 배반포기배 모두 PZM-5 배양액 조건에서 분할율(60.3 vs, 46.6%)과 배반포기로의 발달율이 PZM-5 배양액(27.4 vs, 11.1%)에서 유의적으로 높은발달율을 보였다. 수정란의 배양조건에 따라서 발달율은 다소 차이를 보이기도 한다.
- 본 연구에서 체외성숙을 유도하기 위해서 EGF, LH, FSH 그리고 E?를 배양액에 첨가하였다. 본 실험에서는 혈청의 첨가 그룹에서 수정 후 분할율과배반포기배의 발달율은 77.4%와 25.7%로서 첨가하지 않은 그룹보다 유의적으로(p<0.05) 높은 결과를 보여 호르몬의 첨가가 돼지 난포란의 분할율과 배발달율에 중요한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 난자의 체외성숙은 체외배양 후 44시간 이상 배양하였을 때 Metaphase 口 단계까지 도달하는 난자의 비율로서 평가되는데 체외성숙율의 차이 또한 다양한 원인에 의하여 수정란까지의 발달율에 영향을 미친다.
- 동결 정액에서의 수정율이 저조한 이유로서는 Bamba와 Cran(1988)은 정액의 동결시 glycerol이 돼지의 정자의 활력과 정상첨체의 비율이 감소와 함께 이ycerol의화학적 독성이나 금속 융해시의 삼투압 충격 때문이라고 하였다. 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 분할율과 배반포기배까지의 발달율의 저조는 이러한 이유와 상관이 있는 것으로 여겨진다. 이러한 점을 극복하기 위하여 비침투성 동결 보호제로 사용되는 sucrose를 동결 보호제에 첨가함으로써 수정란에 유해 한 삼투압의 변화를 피하여 손상을 최대한 줄이기 위해서 (Cuello 등, 2004b) 사용되기도 한다.
- 전체 사용한 수정란은 588개의 난자를 공시하여 실험에 사용하였다. 수정 후 분할율에 있어서는 신선정액이 66.7% 로서 43.7%인 동결정액을 사용한 것보다 유의적으로(p<0.05) 높은 발달율을 보였다. 그리고 배반포기로의 발달율에서도 신선 정액이 21.
- 4 vs, 11%). 신선정액과 동결정액의 사용에 의한 분할율에서는 신선정액이 유의적(p<0.05) 으로 높은 결과(66.7 vs 43.7%)를 보였으나, 후기배로의 발달율(21.5 vs 12.1%)에는 차이가 나타나지 않았다. 돼지 체외수정란의 동결 융해 후 생존성에서는 재확장율과 부화수정란의생존성에서도 두 그룹간의 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 초자화 동결보존 방법에서 다소 높은 경향을 보였다.
- 동결 융해후 형태적으로 원래의 수정란으로 되돌아오는 재확장율과 재확장 후 부화 단계까지의 생존성의 조사에서 각 처리 구에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 완만 동결에서의 재획- 장율은 약 10% 수준이며, 초자화 동결 방법에서는 13% 수준으로서 초자화 동결이 다소 높은 재확장율을 보였다. 그러나 부화 단계까지는 두 그룹에서 1~2% 수준으로 낮은 결과를 보였다.
- 핵과 세포질의 성숙을 위해서 체외배양시 표피 성장 인자를 첨가할 때 다소 높은 핵성숙율을 보인다고 Ding과 Fox- croft(1994)는 보고하였다. 이러한 결과는 본 실험에서도 EGF를 첨가하여 높은 핵성숙율을 보인 것과 유사한 결과를 나타내어 체외성숙시 EGF의 첨가로 체외수정란 생산 효율을 증대시킬 수 있을 것이라고 사료된다. 난포란의 체외성숙율의 성공은 수정란의 후기배로의 발달과 정상적인 수정란의 형태로 발달을 할 수 있는 것이다.
- 배양액의 조건에 따른 수정란의 발달율 조사에 대한 보고로서 Okada 등(2006) 은 수정 후 4일째 PZM 배양액에 10%의 혈청을 첨가하였을 때 배반포기배의 발달율은 47%의 결과를 나타내었고, 세포 수에 있어서도 57개 수준으로 첨가하지 않은 그룹보다 유의적으로 높은 배발달율을 보였다. 이러한 연구 결과로 미루어 볼 때 수정란의 분할율과 후기배로의 배발달율에도 기본 배양액에 10% 혈청을 첨가하는 것이 더 높은 발달율을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 그리고 최 등(2009)은 체외수정 후 2~4세포기 수정란을 외과적으로 이식하여 산자를 생산하기도 하였으나, 배반포기 수정란의 비외과적 이식을 위해서는 아직도 돼지 수정란의 배양체계에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 05) 높은발달율을 나타내었다. 체외배양 조건에서 호르몬의 첨가 그룹이 분할율과 발달율에서 유의적(p<0.05)으로 높은 결과를 보였다. 체외수정후 체외배양 조건에 따른 수정란의 분할율과 배반포기배의 발달율에서는 PZM-5 그룹이 NCSU 그룹보다 분할율(60.
- 05)으로 높은 결과를 보였다. 체외수정후 체외배양 조건에 따른 수정란의 분할율과 배반포기배의 발달율에서는 PZM-5 그룹이 NCSU 그룹보다 분할율(60.3 vs 46.6%0과 배반포기까지 발달율에서는 유의적으로 (p<0.05) 높은 결과를 보였다<27.4 vs, 11%). 신선정액과 동결정액의 사용에 의한 분할율에서는 신선정액이 유의적(p<0.
후속연구
- 돼지 체외수정란의 동결 융해 후 생존성에서는 재확장율과 부화수정란의생존성에서도 두 그룹간의 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 초자화 동결보존 방법에서 다소 높은 경향을 보였다. 결론적으로 돼지 수정란의 생산과 동결 보존 기술의 확립으로 유전자원의 효율적인 보존과 복원을 위해서 체외배양체계와 동결 방법 개선, 그리고 정액의 동결 보존 기술 개발에 보다 많은 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
- 8 M Ethylene을 사용함으로써 다른 동결 보호제보다 독성이 적어 부화 단계까지 수정란이 발달할 수 있었던 것으로 사료된다. 그리고 Nagashi- ma 등(1995b)은 1.8 M Glycerol 동결 보호제를 이용하였을 때배반포 수정란이 회복된 비율은 23.6%로 보고하여 연구 자간의 실험 조건에 따라서도 생존율은 다양하게 나타나는 것으로 보아 돼지 수정란의 동결 보존에 대한 연구는 더 많이 진행되어야 하며, 동결 연구의 궁극적인 목적은 멸종 위기 동물이나 희귀품종 또는 우수한 형질을 지닌 개체의 유전자원의 확보와 보존 측면에서 더 많은 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- 이러한 연구 결과로 미루어 볼 때 수정란의 분할율과 후기배로의 배발달율에도 기본 배양액에 10% 혈청을 첨가하는 것이 더 높은 발달율을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 그리고 최 등(2009)은 체외수정 후 2~4세포기 수정란을 외과적으로 이식하여 산자를 생산하기도 하였으나, 배반포기 수정란의 비외과적 이식을 위해서는 아직도 돼지 수정란의 배양체계에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이러한 점을 극복하기 위하여 비침투성 동결 보호제로 사용되는 sucrose를 동결 보호제에 첨가함으로써 수정란에 유해 한 삼투압의 변화를 피하여 손상을 최대한 줄이기 위해서 (Cuello 등, 2004b) 사용되기도 한다. 동결 정액의 제조 방법을 비롯한 수정 방법의 개선 및 배양 조건 개선을 통하여 보다 효과적 인정액 생산 체계에 따른 연구가 더 많이 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
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