Methylation Specific PCR-RFLP 방법을 이용한 Beckwith Wiedemann Syndrome의 진단 Genetic Diagnosis of Beckwith Wiedemann Syndrome using Methylation Specific PCR-RFLP Method원문보기
목 적: Beckwith-Wiedemann 증후군(BWS)은 11p15 부위의 메칠화 양상의 이상으로 인한 overgrowth malformation symdrome이다. 11p15 부위에는 두 가지 imprinting center, 즉BWSIC1 (IGF2, H19)와 BWSIC2 (LIT1,KvDMR)가 존재한다. 본 연구에서는 methylation-specific (MS) PCR RFLP 방법을 이용한 BWS의 유전적 진단을 보고하고자 한다. 대상 및 방법: 임상 소견을 바탕으로 12명의 BWS 환자가 포함되었다. 환자의 말초혈액으로부터 염색체 핵형을 조사하였다. 분리한 DNA에 bisulfite를 처리한 후, LIT1, H19, IGF2 DMR부위는 각각의 MS primer를 이용하여 증폭하였다. 적절한 제한효소를 이용하여 절단 여부를 PAGE로 확인함으로써 각각의 DMR 부위에 대한 메칠화 이상 여부를 확인하였다. 결 과: 12명의 환자는 모두 정상 핵형을 보였다. MS-PCR RFLP 상 총 7명(53.8%)의 환자가 이상 소견을 보였으며, 모두 BWSIC2 (LIT1)에 비정상적 메칠화를 보였고 모두 부계 유래의 비메칠화된 allele만이 발견되었다. 결 론: 본 연구를통해MS-PCR RFLP 검사로BWS 환자의 약 50-60% 정도에서 유전적 진단이 가능함을 알 수 있었으며, 이는 BWSIC2 부위의 메칠화 이상을 발견하는데 손쉽게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나, BWSIC1 부위의 메칠화 이상은 발견이 어려우며, 이 부위의 이상을 발견하기 위해서는 메칠화를 정량적으로 분석할 수 있는 방법이 필요하다.
목 적: Beckwith-Wiedemann 증후군(BWS)은 11p15 부위의 메칠화 양상의 이상으로 인한 overgrowth malformation symdrome이다. 11p15 부위에는 두 가지 imprinting center, 즉BWSIC1 (IGF2, H19)와 BWSIC2 (LIT1,KvDMR)가 존재한다. 본 연구에서는 methylation-specific (MS) PCR RFLP 방법을 이용한 BWS의 유전적 진단을 보고하고자 한다. 대상 및 방법: 임상 소견을 바탕으로 12명의 BWS 환자가 포함되었다. 환자의 말초혈액으로부터 염색체 핵형을 조사하였다. 분리한 DNA에 bisulfite를 처리한 후, LIT1, H19, IGF2 DMR부위는 각각의 MS primer를 이용하여 증폭하였다. 적절한 제한효소를 이용하여 절단 여부를 PAGE로 확인함으로써 각각의 DMR 부위에 대한 메칠화 이상 여부를 확인하였다. 결 과: 12명의 환자는 모두 정상 핵형을 보였다. MS-PCR RFLP 상 총 7명(53.8%)의 환자가 이상 소견을 보였으며, 모두 BWSIC2 (LIT1)에 비정상적 메칠화를 보였고 모두 부계 유래의 비메칠화된 allele만이 발견되었다. 결 론: 본 연구를통해MS-PCR RFLP 검사로BWS 환자의 약 50-60% 정도에서 유전적 진단이 가능함을 알 수 있었으며, 이는 BWSIC2 부위의 메칠화 이상을 발견하는데 손쉽게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 그러나, BWSIC1 부위의 메칠화 이상은 발견이 어려우며, 이 부위의 이상을 발견하기 위해서는 메칠화를 정량적으로 분석할 수 있는 방법이 필요하다.
Purpose: Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) is an overgrowth malformation syndrome caused by a methylation abnormality at chromosome 11p15, consisting of two imprinting centers, BWSIC1 (IGF2, H19) and BWSIC2 (LIT1, KvDMR). This study evaluated the applicability of a methylation-specific (MS) PCR RFLP...
Purpose: Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) is an overgrowth malformation syndrome caused by a methylation abnormality at chromosome 11p15, consisting of two imprinting centers, BWSIC1 (IGF2, H19) and BWSIC2 (LIT1, KvDMR). This study evaluated the applicability of a methylation-specific (MS) PCR RFLP method for the genetic diagnosis of BWS. Materials and Methods: A total of 12 patients were recruited based on clinical findings. Karyotyping was performed using peripheral blood leukocytes, and genomic DNA was treated with bisulfate and amplified using methylation-specific primers. RFLP was conducted with restriction enzymes in differentially methylated regions of LIT1, H19, and IGF2. Results: The 12 BWS patients had normal karyotypes. Abnormal methylation patterns in the BWSIC2 (LIT1) region were identified in seven patients (58.3%) using the MS-PCR RFLP method. Conclusions: The MS-PCR RFLP method is a simple, economical genetic test. It detected genetic abnormalities in 50-60% of BWS patients, suggesting that it can be used as a screening test. A more precise method is required, however, to enhance the detection rate of genetic abnormalities, especially in BWSIC1 region.
Purpose: Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) is an overgrowth malformation syndrome caused by a methylation abnormality at chromosome 11p15, consisting of two imprinting centers, BWSIC1 (IGF2, H19) and BWSIC2 (LIT1, KvDMR). This study evaluated the applicability of a methylation-specific (MS) PCR RFLP method for the genetic diagnosis of BWS. Materials and Methods: A total of 12 patients were recruited based on clinical findings. Karyotyping was performed using peripheral blood leukocytes, and genomic DNA was treated with bisulfate and amplified using methylation-specific primers. RFLP was conducted with restriction enzymes in differentially methylated regions of LIT1, H19, and IGF2. Results: The 12 BWS patients had normal karyotypes. Abnormal methylation patterns in the BWSIC2 (LIT1) region were identified in seven patients (58.3%) using the MS-PCR RFLP method. Conclusions: The MS-PCR RFLP method is a simple, economical genetic test. It detected genetic abnormalities in 50-60% of BWS patients, suggesting that it can be used as a screening test. A more precise method is required, however, to enhance the detection rate of genetic abnormalities, especially in BWSIC1 region.
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문제 정의
일반적으로 유전체 메칠화 양상을 확인하는 방법은 DNA에 bisulfite를 처리하여 메칠화 되지 않은 cytosine 염기를 uracil로 변성시킨 후, 변성이 방지된 메칠화된 cytosine과 구분하는 methylation specific PCR (MS-PCR) 방법5)이 이용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 11번 염색체의 BWSIC1과 BWSIC2의 메칠화 양상을 확인할 수있는 MS-PCR 방법을 이용한 BWS의 유전적 진단에 관하여 보고하고자 한다.
제안 방법
이들 12명의 환자들을 대상으로 염색체 검사를 시행하였고, 모두 정상이었다. MS-PCR을 시행하였으며, H19, IGF2, LIT1 부위는 각각 230bp, 255bp, 179bp의 크기로 증폭되었다(Fig. 2A). 제한효소 처리 후 결과에서 H19의 경우 메칠화된 부계 allele에 제한효소 XmnI이 작용하여, 162bp와 68bp의 절단산물이 나타났고, IGF2는 메칠화된 모계 allele에 제한 효소 BsaBI이 작용하여 235bp와 20bp의 절단산물이 나타냈다.
PCR 반응에 사용된 시발체의 염기서열은 bisulfite 에 의해 변성된 염기들에 대한 염기서열을 반영하였고 Table 1과 같다. PCR 반응은 20 ul를 최종용적으로 100 ng의 변성된 주형 DNA, 1pmole의 각각의 시발체, 200 uM dNTPs, 1.5mM MgCl 2 , 50 mM KCl, 10 mM TrisCl (pH 8.3) 조건에서 1unit의 Taq polymerase (Promega, USA)를 이용하여, 94℃ 30초 분리, 60℃에서 30초간 교잡, 72℃에서 45초간 반응과정을 PTC200 (MJ-Research, USA)을 이용하여 35회 반복하였다. 증폭된 산물은 1.
5% agarose 젤에서 증폭 여부를 확인하였고, 증폭된 산물 4 ul에 제한효소 XmnI, BsaBI, NlaIII (NEB, USA)을 각각 1 unit 처리하여 37℃에서 3시간 반응하였다. 그 후 제한효소의 절단 여부를 확인하기 위해 8% polyacrylamide 젤 전기영동을 시행하였다.
5M sodium bisulfate를 녹여 사용하였 다. 변성된 DNA는 잔존하는 bisulfite를 제거하기 위하여 column방식의 DNA 분리키트인 GeneAll (Generalbiosystems, Korea)를 이용하여 정제한 후 PCR반응의 주형으로 사용하였다. PCR 반응에 사용된 시발체의 염기서열은 bisulfite 에 의해 변성된 염기들에 대한 염기서열을 반영하였고 Table 1과 같다.
3) 조건에서 1unit의 Taq polymerase (Promega, USA)를 이용하여, 94℃ 30초 분리, 60℃에서 30초간 교잡, 72℃에서 45초간 반응과정을 PTC200 (MJ-Research, USA)을 이용하여 35회 반복하였다. 증폭된 산물은 1.5% agarose 젤에서 증폭 여부를 확인하였고, 증폭된 산물 4 ul에 제한효소 XmnI, BsaBI, NlaIII (NEB, USA)을 각각 1 unit 처리하여 37℃에서 3시간 반응하였다. 그 후 제한효소의 절단 여부를 확인하기 위해 8% polyacrylamide 젤 전기영동을 시행하였다.
대상 데이터
PCR amplifications were carried out using the methylation-specific primers listed in Table 1 after DNA modification by bisulfite. The products were 230bp, 179bp, 255bp for H19, LIT1, IGF2, respectively.(B) 8% polyacrylamide gel electrophoresis.
서울아산병원 의학유전학클리닉으로 의뢰된 12명의 BWS 환자를 대상으로 하였다. Genomic DNA는 PUREGENE DNA isolation kit (Gentra, Minneapolis, USA)를 이용하여 환자의 말초혈액으로부터 분리하였다.
성능/효과
BWS 환자의 약 40%는 BWSIC2에서 메칠화 이상을 보이 며, 이는 가장 흔한 빈도를 보이는 유전적 이상이다. BWS 환자의 20-25%는 11p15부위에서 부계 유래의 uni-parental disomy (UPD)를 보이고, 약 10%의 BWS 환자는 BWSIC1의 돌연변이에 의한 H19 및 IGF2의 비정상적 메칠화를 보이며, 나머지 약 30%의 환자는 정상 메칠화 양상을 보인다4). 따라서, 11번 염색체의 메칠화 양상을 확인함으로써 전체 BWS 환자의 약 70%에 대한 유전적 진단이 가능하다.
H19의 경우, 부계 allele이 메칠화되어 있어 zinc finger protein인 CTCF (CCCTC-binding factor)의 영향을 받지 않아 부계로부터 유래된 allele에서는 발현이 되지 않는 반면 IGF2가 발현이 되고, 모계로부터 유래된 allele에서는 CFCF binding domain이 비메칠화되어 있어 CTCF가 결합하게 되고 결과적으로 H19가 발현됨으로써 IGF2의 발현이 억제된다. H19 DMR 부위에서 모계 allele이 메칠화되면, 결과적으로 IGF2가 과메칠화(hypermethylation) 되면서 H19의 발현억제과 IGF2의 과발현을 초래함으로써 BWS가 유래된다. 반대로 부계의 H19 DMR이 비메칠화되어 IGF2가 저메칠화(hypomethylatin)이 되면, H19가 과발현되고 IGF2의 발현이 억제됨으로써 성장이 저해되는 Silver-Russell syndrome이 초래된다 10).
BWS 환자의 20-25%는 11p15부위에서 부계 유래의 uni-parental disomy (UPD)를 보이고, 약 10%의 BWS 환자는 BWSIC1의 돌연변이에 의한 H19 및 IGF2의 비정상적 메칠화를 보이며, 나머지 약 30%의 환자는 정상 메칠화 양상을 보인다4). 따라서, 11번 염색체의 메칠화 양상을 확인함으로써 전체 BWS 환자의 약 70%에 대한 유전적 진단이 가능하다. 일반적으로 유전체 메칠화 양상을 확인하는 방법은 DNA에 bisulfite를 처리하여 메칠화 되지 않은 cytosine 염기를 uracil로 변성시킨 후, 변성이 방지된 메칠화된 cytosine과 구분하는 methylation specific PCR (MS-PCR) 방법5)이 이용되고 있다.
본 연구를 통하여 bisulfite 처리를 이용한 MS-PCR RFLP 방법으로 약 60%의 BWS 환자에 대한 유전적 진단이 가능하였다. 하지만, 본 방법으로는 부분적 메칠화 이상을 발견할 수는 없었으며, 진단 양성률을 높이기 위한 방법의 도입이 필요하다고 판단된다.
2A). 제한효소 처리 후 결과에서 H19의 경우 메칠화된 부계 allele에 제한효소 XmnI이 작용하여, 162bp와 68bp의 절단산물이 나타났고, IGF2는 메칠화된 모계 allele에 제한 효소 BsaBI이 작용하여 235bp와 20bp의 절단산물이 나타냈다. LIT1은 비메칠화된 부계 allele에 제한효소 NlaIII가 작용 하여 149bp와 30bp의 절단산물이 나타냈다(Fig.
후속연구
하지만, 본 방법으로는 부분적 메칠화 이상을 발견할 수는 없었으며, 진단 양성률을 높이기 위한 방법의 도입이 필요하다고 판단된다. 그러나 FISH, microsatellite 분석, MSMLPA 방법 등이 고가의 장비와 시약 비용이 필요한 방법이므로, 여기서 소개한 MS-PCR RFLP 방법은 비교적 경제적이고 사용자에게 친화적인 손쉬운 방법으로 선별적 유전자 검사로 용의하게 이용될 수 있을 것이다.
본 연구를 통하여 bisulfite 처리를 이용한 MS-PCR RFLP 방법으로 약 60%의 BWS 환자에 대한 유전적 진단이 가능하였다. 하지만, 본 방법으로는 부분적 메칠화 이상을 발견할 수는 없었으며, 진단 양성률을 높이기 위한 방법의 도입이 필요하다고 판단된다. 그러나 FISH, microsatellite 분석, MSMLPA 방법 등이 고가의 장비와 시약 비용이 필요한 방법이므로, 여기서 소개한 MS-PCR RFLP 방법은 비교적 경제적이고 사용자에게 친화적인 손쉬운 방법으로 선별적 유전자 검사로 용의하게 이용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
일반적으로 유전체 메칠화 양상을 확인하는 방법은 무엇이 있는가?
따라서, 11번 염색체의 메칠화 양상을 확인함으로써 전체 BWS 환자의 약 70%에 대한 유전적 진단이 가능하다. 일반적으로 유전체 메칠화 양상을 확인하는 방법은 DNA에 bisulfite를 처리하여 메칠화 되지 않은 cytosine 염기를 uracil로 변성시킨 후, 변성이 방지된 메칠화된 cytosine과 구분하는 methylation specific PCR (MS-PCR) 방법5)이 이용되고 있다. 따라서 본 연구에서는 11번 염색체의 BWSIC1과 BWSIC2의 메칠화 양상을 확인할 수있는 MS-PCR 방법을 이용한 BWS의 유전적 진단에 관하여 보고하고자 한다.
Beckwith Wiedemann 증후군은 무엇에 의해 발생하는가?
Beckwith Wiedemann 증후군(BWS)는 1963년 Beckwith JB와 1964년 Wiedemann HR에 의해 처음 보고된 질환으로1,2), 거구증(macrosomia), 대설증(macroglossia), 배꼽탈장 (omphalocele), ear creases, viceromeglay (신장이나 간 등의 비대증), embryonal tumor, hemihyperplasia, 부신피질세 포거대증(adrenocortical cytomegaly), 그리고 저혈당증 등의 주요 증상을 특징으로 한다. BWS는 11번 염색체에서의 유전체 각인(genomic imprinting)의 이상에 의해 발생되며, 11p15 위치에 있는 H19 DMR (differentially methylated region)로 알려진 BWSIC1과 KCNQ1 DMR로 알려진 BWSIC2인 두 개의 imprinting center가 연관되어 있다3).BWSIC1은 종양 억제 기능을 가지는 non-coding RNA에 대한 유전자인 H19와 IGF2 (insulin-like growth factor2) 유전자의 발현 조절에 관여하는 메칠화 군집으로 부계로부터 유래된 allele이 메칠화되어 있다.
Beckwith Wiedemann 증후군의 증상에는 무엇이 있는가?
Beckwith Wiedemann 증후군(BWS)는 1963년 Beckwith JB와 1964년 Wiedemann HR에 의해 처음 보고된 질환으로1,2), 거구증(macrosomia), 대설증(macroglossia), 배꼽탈장 (omphalocele), ear creases, viceromeglay (신장이나 간 등의 비대증), embryonal tumor, hemihyperplasia, 부신피질세 포거대증(adrenocortical cytomegaly), 그리고 저혈당증 등의 주요 증상을 특징으로 한다. BWS는 11번 염색체에서의 유전체 각인(genomic imprinting)의 이상에 의해 발생되며, 11p15 위치에 있는 H19 DMR (differentially methylated region)로 알려진 BWSIC1과 KCNQ1 DMR로 알려진 BWSIC2인 두 개의 imprinting center가 연관되어 있다3).
참고문헌 (10)
Weksberg R, Shuman C, Smith AC. Beckwith-Wiedemann syndrome. Am J Med Genet C Semin Med Genet 2005;137:12-23.
Wiedemann HR. Familial malformation complex with umbilical hernia and macroglossia: "A new syndrome?" J Genet Hum 1964;13:223-32.
Bliek J, Maas SM, Ruijter JM, Hennekam RC, Alders M, Westerveld A, et al. Increased tumour risk for BWS patients correlates with aberrant H19 and not KCNQ1OT1 methylation: occurrence of KCNQ1OT1 hypomethylation in familial cases of BWS. Hum Mol Genet 2001;10:467-76.
Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci 1992;89:1827-31.
Kim GH, Lee BH, Yoo HW. MLPA applications in genetic testing. J Genet Med 2009;6:146-54.
Shuman C, Smith AC, Weksberg R. Beckwith-Wiedemann syndrome. 2008. May. GenReviews PMID20301568. Available from: http://www.genetests.org
Li M, Squire J, Shuman C, Fei YL, Atkin J, Pauli R, et al. Imprinting status of 11p15 genes in Beckwith-Wiedemann syndrome patients with CDKN1C mutations. Genomics 2001;74:370-6.
Ulaner GA, Vu TH, Li T, Hu JF, Yao XM, Yang Y, et al. Loss of imprinting of IGF2 and H19 in oseteosarcoma is accompanied by reciprocal methylation changes of CTCF-binding site. Hum Mol Genet 2003;12:535-49.
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