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문제 정의
- 이러한 견지에서 볼 때 항산화계와 관련된 기능성 물질로서 상황버섯의 이용을 기대해 볼 수 있는데 따라서 본 연구에서는 고지방 · 고콜레스테롤 식이를 공급한 흰쥐에서 상황버섯 추출물을 농도별로 공급하였을 시 혈액과 조직에서 생리활성에 미치는 영향을 관찰하고, 이러한 결과를 바탕으로 상황버섯의 혈중 지질대사와 간 조직에서의 항산화방어계의 개선효능을 검증하고자 하였다.
가설 설정
-
05 by Tukey's test. The experimental groups are the same as in Table 1.
1)NS: not significant
.
제안 방법
- 간장을 각 간엽에서 고르게 일정량을 취하여 Potter Elvejhem homogenizer를 사용하여 0.25 M sucrose/0.5 mM ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)/5 mM N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid(HEPES) 용액으로써 10%(w/v) 마쇄액을 만들었다. 마쇄액의 일부를 8,000×g에서 20분간 원심분리 하여 그 상층액을 과산화지질 정량에 사용하였고, 나머지는 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 그 상층액 중 일정량을 취하여 0.
- 간조직의 총지질의 함량은 Folch 등(23)의 방법에 의해 추출하여 정량하였고, 간조직 지질의 정량에서는 Sale 등(24)의 수정된 방법으로 중성지방과 콜레스테롤 측정용 효소시액에 유화제로서 0.5% triton X-100과 3 mM sodium cholate를 혼합하여 발색 시 일어나는 탁도(turbidity)를 제거하여 간조직의 triglyceride와 cholesterol 농도를 550 nm와 500 nm에서 각각 흡광도를 측정하였다.
- , Gyeonggi, Korea)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 그리고 혈청 총콜레스테롤의 함량 또한 표준 효소법에 의해 kit(Asan Co.)를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 HDL-콜레스테롤은 2%, dextron sulfate와 1 M의 MgCl2 침전액을 1:1의 비율로 혼합하여 12,000 rpm에서 8분간 원심분리 하여 그 상층액을 시료로 표준 효소법에 의해 kit(Asan Co.
- , Gyeonggi, Korea)를 이용하여 95℃에서 12시간 1차 추출을 하였다. 다음 원료무게 대비 5배의 물을 가하여 extractor를 이용하여 95℃에서 12시간 2차 추출한 후 1차, 2차 추출물을 혼합하여 여과(200 mesh)한 다음 상기 여과액을 concentrator(J-002, J-003, Jeil Machine Co.)를 이용하여 농축 후 고형분 검사를 행하여 추출물을 95℃에서 살균하여 상황버섯 추출물을 얻었다. 본 실험에 사용된 상황버섯의 β-글루칸 함량은 상황버섯 자실체 100 g당 5 g이 함유되어 있었다.
- 또 10,000×g 상층액의 일부는 다시 105,000×g에서 30분간 원심분리 하여 얻은 cytosol은 GSH-px의 활성도를 측정하였다.
- 마쇄액의 일부를 8,000×g에서 20분간 원심분리 하여 그 상층액을 과산화지질 정량에 사용하였고, 나머지는 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 그 상층액 중 일정량을 취하여 0.4배량의 ethanol : chloroform 냉혼합액(5:3)을 가하고 2분간 진탕한 다음 10,000×g에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 세포질 SOD원액으로 사용하였다.
- 본 연구는 상황버섯추출액을 고지방·고콜레스테롤 쥐에 농도별로 50 mg/kg b.w(PA group), 100 mg/kg b.w(PB group)의 수준으로 공급하였을 시 지질대사 및 항산화 방어계에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 식이 groups은 정상군(N group)과 1% 고지방 · 고콜레스테롤 식이 실험군으로 나눈 후 고지방 · 고콜레스테롤 실험군은 고지방 · 콜레스테롤 대조군(HF group), 상황버섯 공급군은 매일 상황버섯 추출물을 50 mg/kg b.w(PA group), 100 mg/kg b.w(PB group)의 수준으로 물병에 녹여 공급한 군으로 총 4군으로 나누어 사육하였다.
-
체중증가량, 식이섭취량, 식수섭취량 및 식이효율
식이섭취량과 식수섭취량은 전 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정하였으며 체중은 3일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 줌으로 계산하였다.
- 식이섭취량과 식수섭취량은 전 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정하였으며 체중은 3일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 줌으로 계산하였다.
- , Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 환경에 적응시키기 위해 일주일간 예비사육한 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 대조군과 실험군으로 나눈 후 Table 1과 같이 나누어 4주간 사육하였다. 실험 기간 중 식이는 4℃에서 보관하였으며 매일 일정 시간에 공급하여 자유로이 섭취하게 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 상황버섯(Phellius linteus)은 진주시 문산읍 삼곡리 소재 (주)금황바이오에서 재배되는 것을 구입하여 건조한 후 추출 · 농축하여 실험용 재료로 사용하였다.
- 실험동물은 체중 110±10 g 내외의 Sprague-Dawley 종 수컷을 바이오 제노믹스(Bio Genomics, Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 분산분석(ANOVA 검증) 결과 유의성이 발견된 경우 Tuckey's HSD test(29)에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다.
이론/모형
- SOD 활성은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Markund의 방법(25)에 따라 측정하였다. GSH-px활성은 산화형 glutathione(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의해 환원될 때 340 nm에서 NADPH의 흡광도가 감소하는 것을 이용한 Lawerence와 Burk의 방법(26)에 따라 측정하였다.
- SOD 활성은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한 Marklund와 Markund의 방법(25)에 따라 측정하였다. GSH-px활성은 산화형 glutathione(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의해 환원될 때 340 nm에서 NADPH의 흡광도가 감소하는 것을 이용한 Lawerence와 Burk의 방법(26)에 따라 측정하였다.
- 각 시료의 단백질량은 Lowry 등(28)의 방법으로 하였으며, bovin serum albumin을 표준품으로 사용하였다.
- 과산화지질 정량은 간 조직의 마쇄액을 8,000 × g에서 처리하여 얻은 상층액과 TCA용액을 섞은 후, 실온에서 10분간 방치한 다음 0.05 M 황산으로 세척한 후 그 침전물과 thiobarbituric acid(TBA)와 반응하여 생성되는 malondialdehyde를 측정하는 Satoh법(27)을 이용하였다.
- )를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 HDL-콜레스테롤은 2%, dextron sulfate와 1 M의 MgCl2 침전액을 1:1의 비율로 혼합하여 12,000 rpm에서 8분간 원심분리 하여 그 상층액을 시료로 표준 효소법에 의해 kit(Asan Co.)를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량은 Friedewald의 계산법(21)으로, 그리고 혈청동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 Fiordaliso의 계산법(22)으로 각각 산출하였다.
- )를 사용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량은 Friedewald의 계산법(21)으로, 그리고 혈청동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 Fiordaliso의 계산법(22)으로 각각 산출하였다.
- 혈청 내 중성지질의 함량은 표준 효소법에 의해 kit(Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 그리고 혈청 총콜레스테롤의 함량 또한 표준 효소법에 의해 kit(Asan Co.
성능/효과
- 3) 또한 정상군에 비해 고지방·고콜레스테롤군에서 유의적으로 증가되었으며 상황버섯 공급군은 유의적으로 감소되었고 PB군에서 정상군 수준으로 감소되었다.
- 3) 중성지질의 양은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다.
- GPx를 관찰한 결과(Fig. 2) 정상군에 비해 고지방·콜레스테롤 공급군에서 감소되었고 상황버섯을 공급한 PA군과 PB군에서 고지방 · 콜레스테롤에 비해 증가하였으며 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군은 유의적으로 증가하였다.
- HDL-cholesterol(Table 3)은 고지방 · 고콜레스테롤군은 정상군에 비해 유의적으로 감소하였고 상황버섯을 공급한 군은 고지방 · 고콜레스테롤군에 비해 유의적이지는 않지만 증가하였다.
- HDL-cholesterol은 정상군은 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적으로 증가하였고 상황버섯을 공급한 군은 고지방 · 고콜레스테롤군에 비해 증가하였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다.
- LDL-cholesterol 및 동맥경화지수(AI)는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가되었고 상황버섯 공급군은 유의적으로 감소하였으며 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군에서 정상군 수준으로 감소하였다.
- LDLcholesterol(Table 3)은 정상군에 비해 고지방·고콜레스테롤군에서 유의적으로 증가되었고 상황버섯 공급군은 유의적으로 감소하였으며 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군에서 정상군 수준으로 감소하였다.
- 따라서 본 연구에서 상황버섯 속의 β-glucan의 작용으로 혈중 지질대사 효과가 나타난 것으로 사료된다.
- 또한 혈장에서 측정한 결과 상황버섯을 공급한 군 모두에서 정상군 수준으로 감소하였다. 따라서 본 연구의 결과로 미루어 상황버섯은 지질대사 개선작용을 지니고 있으며 항산화계 활성을 지니고 있음이 규명되었다.
- 따라서 상황버섯은 β-glucan의 함량과 버섯에 함유된 수용성 섬유소가 혈중 지질조성을 개선시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 또한 GPx를 관찰한 결과 정상군에 비해 고지방·콜레스테롤 공급군에서 감소되었고 상황버섯을 공급한 PA군과 PB군에서 고지방·콜레스테롤에 비해 증가하였으며 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군은 유의적으로 증가하였다.
- 또한 혈장에서 측정한 결과(Fig. 3)(B) 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 상황버섯을 공급한 군 모두에서 정상군 수준으로 감소하였으나 유의적인 감소는 나타내지 않았다.
- 본 실험에 사용된 상황버섯의 β-글루칸 함량은 상황버섯 자실체 100 g당 5 g이 함유되어 있었다.
- 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다. 상황버섯을 공급한 PA군과 PB군은 모두 정상군 수준으로 감소하였다. 이는 상황버섯 다당체 투여로 인해 혈장 중성지방과 총콜레스테롤 농도가 저하한다는 Kim 등(32)의 연구와 유사하였다.
- 생체 조직의 과산화적 손상 지표가 되는 간의 지질과산화물(TBARS) 함량을 간 조직에서 측정한 결과 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 상황버섯을 공급한 모든 군에서 감소하였다.
- 생체 조직의 과산화적 손상 지표가 되는 간의 지질과산화물(TBARS) 함량을 간 조직에서 측정한 결과(Fig. 3)(A) 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 상황버섯을 공급한 군에서 감소하였으며 특히 PB군은 유의적으로 감소하였다.
- 중성지질의 양은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였으며 상황버섯을 공급한 PA군과 PB군은 모두 정상군 수준으로 감소하였다.
- 체중증가량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가되었으나 상황버섯 공급군에서는 체중의 감소가 나타났다.
- 체중증가량은 정상군에 비해 고지방·고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가되었으나 상황버섯 공급군에서는 체중의 감소가 나타났다.
- 총콜레스테롤은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군은 유의적으로 증가하였으며 상황버섯 공급군 PA, PB군은 감소하였다.
- 총콜레스테롤은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤군은 유의적으로 증가하였으며 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군은 HF군에 비해 유의적으로 감소되었다.
- 체중증가량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가되었으나 상황버섯 공급군에서는 체중의 감소가 나타났다. 특히 상황버섯 농도를 높게 한 PB군은 유의적으로 감소되었다. 식이효율 또한 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였으나 상황버섯을 공급한 군에서는 감소하였고 PB군은 정상군 수준으로 되었다.
후속연구
- 본 연구 결과로 고지방 · 콜레스테롤의 섭취로 인한 간조직의 산화적 스트레스가 상황버섯 추출물이 체내 항산화능 개선에 효과가 있으리라 기대 할 수 있었다.
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