선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 상황버섯(PL)과 상황버섯균사체를 접종시켜 20일간 배양한 상황버섯균사체배양쌀 추출물(PLM)의 항당뇨와 항비만 효과를 규명하고자 하였다. 지방축적 억제 효과를 확인하기 위하여 분화유도 후 8일째에 Oil Red O 염색을 통해 세포 내 형성된 lipid droplet을 isopropanol에 용출하여 500 nm에서 흡광도를 측정한 결과 PL 3, 30, 100, 300 μg/mL에서 P<0.
- 이에 본 연구에서는 비만과 당뇨병의 발병 기전 및 원인에 관한 연구를 통하여 상황버섯과 상황버섯균사체배양쌀 80% ethanol 추출물인 PL과 PLM을 대상으로 지금까지 연구된 생리활성 이외에 항당뇨와 항비만 효과를 확인하기 위하여 추출물을 탐색하고, 이를 당뇨와 비만에 예방 혹은 치료 기능이 있는 기능성 식품 소재로 개발하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 28일간 실험식이를 경구투여 한 후 종료일에 실험동물을 ethyl ether로 마취하여 심장에서 채혈하고, 채혈된 혈액은 실온에서 1시간 두었다가 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 혈청을 분석시료로 사용하였다.
- 샘플처리는 분화시작일과 2, 4, 6일째 되던 날에 양성대조군 orlistat 20 μM과 시료를 각각 농도별로(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL) 처리해 주었고, 농도 0은 대조군으로 2일 간격으로 분화유도 배지만 처리하였다. 8일째 되던 날 Oil Red O 염색을 수행하였다.
- CETP 함량은 CETP inhibitor assay kit(Biovision)를 사용하여 측정하였다. 96 well plate에 160 μL의 샘플을 넣은 후, rabbit serum 3 μL를 넣고 반응시켰다.
- 세포 내 지방 축적의 대부분이 중성지방이기 때문에 분화된 3T3-L1 adipocyte 는 염색이 가능하다. PL과 PLM을 처리한 세포 내 지방 축적에 대한 효과를 측정하기 위하여 3T3-L1 세포의 지방세포의 분화 후 Oil Red O solution으로 염색하여 확인하였다(Fig. 1). 그 결과 Fig.
- 분화유도 2일 후는 10 μg/mL의 insulin이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 4, 6일 째 10% FBS DMEM으로 배양액을 교체하여 지방세포 분화를 유도하였다. 샘플처리는 분화시작일과 2, 4, 6일째 되던 날에 양성대조군 orlistat 20 μM과 시료를 각각 농도별로(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL) 처리해 주었고, 농도 0은 대조군으로 2일 간격으로 분화유도 배지만 처리하였다.
- 중성지방의 농도가 증가할수록 지방운송단백질인 CETP의 활성이 증가하는데 CETP 억제제는 지질대사를 조절하는 약물로 알려져 있다. 따라서 PL과 PLM을 처리하여 HDL의 혈중 농도를 확인하였다(Fig. 2). Fig.
- 샘플처리는 분화시작일과 2, 4, 6일째 되던 날에 양성대조군 orlistat 20 μM과 시료를 각각 농도별로(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL) 처리해 주었고, 농도 0은 대조군으로 2일 간격으로 분화유도 배지만 처리하였다.
- 세포가 postconfluent하게 되면 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액에 0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin 이 첨가된 differentiation medium을 처리하여 분화를 유도 하였다.
- 실험동물은 male Sprague Dawley(SD) rat 5주령을 중앙실험동물(주)(서울)에서 구입하여 1주일간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 실험군은 정상군(normal), 고지방식이 대조군(high fat diet, HFD군), 고지방식이와 상황버섯 80% ethanol 추출물 200 mg/kg/day를 경구 투여한 PL군, 고지방식이와 상황버섯균사체배양쌀 80% ethanol 추출물 200 mg/kg/day를 경구 투여한 PLM군으로 각 군당 5마리씩 총 4군으로 나누어 실험에 사용하였다. 물과 식이는 자유롭게 섭취시키면서 사육하였다.
- Formaldehyde를 제거하고 증류수로 씻어낸 후 각 well에 Oil Red O working solution을 500 μL씩 넣고 실온에서 30분 동안 염색한 후 증류수로 3회 반복하여 씻어내었다. 염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하였으며 100% isopropanol을 가하여 세포 내에 축적된 lipid를 용출하여 96-well plate에 옮긴 후 500 nm에서 흡광도를 측정하여 lipid accumulation 정도를 평가하였다.
- 본 실험에 사용한 상황버섯과 상황버섯균사체를 쌀에 접종시켜 20일간 배양한 상황버섯균사체배양쌀을 80% ethanol을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침출하여 시료로 사용하였다. 추출물은 evaporate(Rotavapor R-220, Buchi, Gschwader Strasse, Switzerland)를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조 하였다. 제조된 분말은 4℃에서 냉장 보관하여 실험 시 사용하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 전지방세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 전지방 세포인 3T3-L1 cell의 세포 배양액으로는 DMEM에 10% BCS와 1% penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 세포가 80~90% confluent되면 0.
- 본 실험에 사용한 상황버섯과 상황버섯균사체를 쌀에 접종시켜 20일간 배양한 상황버섯균사체배양쌀을 80% ethanol을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 침출하여 시료로 사용하였다. 추출물은 evaporate(Rotavapor R-220, Buchi, Gschwader Strasse, Switzerland)를 이용하여 용매를 제거한 후 동결건조 하였다.
- 상황버섯과 상황버섯균사체배양쌀은 ㈜해뜰날(Gunsan, Korea)로부터 공급받아 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA solution, penicillin/ streptomycin은 GIBCO Life Science(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였고, dexamethasone, 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), Oil Red O, orlistat, insulin은 Sigma-Aldrich Co.
-
동물실험
실험동물은 male Sprague Dawley(SD) rat 5주령을 중앙실험동물(주)(서울)에서 구입하여 1주일간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 실험군은 정상군(normal), 고지방식이 대조군(high fat diet, HFD군), 고지방식이와 상황버섯 80% ethanol 추출물 200 mg/kg/day를 경구 투여한 PL군, 고지방식이와 상황버섯균사체배양쌀 80% ethanol 추출물 200 mg/kg/day를 경구 투여한 PLM군으로 각 군당 5마리씩 총 4군으로 나누어 실험에 사용하였다.
- 25 μL의 stop-solution을 넣은 후 반응을 중단시켰다. 형광 강도는 여기파장 502 nm, 측정파장 530 nm에서 측정하였다.
- 각 well에 donor molecule 10 μL, acceptor molecule 10 μL, 10× CETP assay buffer를 20 μL씩 넣어 37°C에서 30분 동안 incubation하였다. 형광강도는 여기파장 465 nm, 측정파장 535 nm에서 측정하였다.
데이터처리
- 실험의 결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 그룹간 차이는 Student's t-test 분석법을 사용하여 통계학적인 유의성을 판정하였으며 P 값이 0.05 미만(P<0.05)인 경우를 통계학적으로 유의하다고 보았다.
이론/모형
- PTP1B 함량은 PTP1B fluorometric assay kit(Abnova)를 사용하여 측정하였다. 96-well plate 각 well에 distilled water 30 μL, 10× PTP assay buffer 30 μL와 10×fluoro-phospho-substrate 5 μL씩 넣은 후 recombinant PTP1B를 첨가하여 상온에서 15분 동안 incubation 하였다.
- 혈청의 중성지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도, GOT, GPT를 자동 혈액 분석기(DRI-CHEM 4000i, FUGI- FILM, Tokyo, Japan)로 측정하였고, LDL-콜레스테롤은 Friedewald 등(10)의 방법에 따라 계산식, 총콜레스테롤－(중성지방+HDL-콜레스테롤)/ 5에 의하여 산출되었다.
성능/효과
- CETP 저해 활성을 측정한 결과 PL 300 μg/mL에서 P<0.05 수준에서 유의한 저해효과가 나타났다.
- 혈청의 GOT 활성은 간세포의 변성과 괴사를 반영하는 효소로서 간 조직 손상 시 혈중으로 다량 유출된다. GOT, GPT 활성은 HFD 군에 비해 PL과 PLM 처리군에서 감소하는 경향을 보였으나 유의한 차이를 보이지 않았다.
- PLM 또한 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL로 처리하였을 때 농도에 의존적으로 7, 8, 18, 21, 26, 40% 저해효과를 보였고, PLM 을 1 μg/mL 처리하였을 때 통계적으로 P<0.05 수준에서의 유의한 저해효과를 나타내었으며, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL로 처리하였을 때 P<0.01 수준에서 유의한 저해효과를 나타내었다(Fig. 3B).
- PLM은 대조군에 비하여 PLM 1 μg/mL에서 통계적으로 P<0.05 수준에서의 유의한 저해효과가 나타났으며 PLM 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 μg/mL에 있어서는 P<0.01 수준에서 유의한 저해효과가 나타났다.
- PLM을 농도별로 처리하였을 때 88, 88, 88, 85, 69, 41% 정도의 지방 축적을 보였으며, 농도 의존적으로 P<0.01 수준에서 유의한 저해효과가 나타났다(Fig. 1B).
- PL을 농도별(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL)로 처리하였을 때 96, 92, 89, 83, 32, 24% 정도의 지방축적을 보였으며, PL 10, 30, 100, 300 μg/mL에서 P<0.01 수준에서 유의한 억제 효과가 나타났다(Fig. 2A).
- 1). 그 결과 Fig. 1A에서 보는 바와 같이 샘플을 처리하지 않고 분화를 유도하였을 경우에는 세포질 내 lipid droplet이 형성되어 사진이 붉게 염색된 것을 확인하였다. PL을 농도별(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL)로 처리하였을 때 96, 92, 89, 83, 32, 24% 정도의 지방축적을 보였으며, PL 10, 30, 100, 300 μg/mL에서 P<0.
- 동물실험실의 사육조건은 온도 23±1°C, 습도 45±5%, 명암은 12시간 주기로 자동 조명 조절되었으며, 체중의 변화는 매일 기록하였다.
- PTP1B 저해물질을 이용한 성인형 비만 및 당뇨병 치료제의 개발에 식물의 새로운 골격을 갖는 저해물질이 발굴되면 이를 출발물질로 새로운 당뇨병 치료제의 개발이 기대되어 현재의 당뇨 치료제 개발에 획기적인 전기를 제공할 수 있다. 따라서 PL, PLM은 체내 조직의 인슐린 신호전달과정에서 탈인산화 작용에 관여하는 PTP1B 효소를 저해함으로써 인슐린의 작용을 높이고 당흡수를 지연시켜, 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 PLM을 농도별(1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/mL)로 처리하였을 때 각각 15, 34, 38, 45, 95, 99%로 농도에 의존적으로 CEPT 활성 저해효과가 나타났고, PLM 100μg/mL에서 P<0.05 수준에서 유의한 저해효과가 나타났으며, PLM 300 μg/mL에서는 P<0.01 수준에서 유의한 저해 효과가 나타났다(Fig. 2B).
- 또한 고지방식이에 PL과 PLM을 28일간 경구투여 하였을 때 총콜레스테롤은 HFD군에 비해 PL, PLM군 모두 유의적인 감소를 나타내었고(P<0.05), 혈청의 중성지방(triglyceride) 농도는 HFD군에 비해 PL군, PLM군은 모두 감소하는 경향을 나타내었으며 통계적으로 P<0.05 수준에서 유의적인 감소를 나타내었다.
- 또한 혈청의 HDL-cholesterol은 HFD군이 52.4±4.3 mg/dL로 나타났고 PL군이 63.2±18.0 mg/dL, PLM군이 65.4±3.4 mg/dL로 HFD처리군보다 증가함을 보였으며, PLM처리군에서 유의적으로 증가하였다(P<0.01).
- 이상의 결과로 미루어 볼 때 PL과 PLM의 투여가 혈중 지질 조성을 개선시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 상황버섯과 상황버섯균사체배양쌀군에서 총콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤을 낮추고 HDL-콜레스테롤을 상승시키는 결과를 초래하여 지질대사 개선에 효과적인 것으로 나타났다. 상황버섯군에 비해 상황버섯균사체배양쌀군이 혈청의 총 콜레스테롤을 낮추고 HDL-cholesterol을 높이는 경향은 상황버섯균사체쌀에 베타글루칸 함량의 상승효과라 사료된다.
- 이 결과를 통해 상황버섯추출물 100, 300μg/mL와 상황버섯균사체배양쌀 추출물 300 μg/mL이 양성대조군 orlistat보다 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적에 대한 억제 효과가 큰 것으로 보아 비만 예방에 효과적일 것으로 기대된다.
- 3 mg/dL로 나타났으며 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 PL과 PLM의 투여가 혈중 지질 조성을 개선시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 상황버섯과 상황버섯균사체배양쌀군에서 총콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤을 낮추고 HDL-콜레스테롤을 상승시키는 결과를 초래하여 지질대사 개선에 효과적인 것으로 나타났다.
- LDL-cholesterol은 HFD 군에 비해 PL군, PLM군에서 감소하였으며, 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과로 보아 상황버섯과 상황버섯균사체 배양쌀은 지방세포의 분화를 억제시키며 PL과 PLM이 혈청 지질 조정을 개선시키는데 효과가 있음을 알 수 있다. 앞으로 항비만, 항당뇨 생리활성을 나타내는 식품소재로서의 개발에 가능성이 있을 것으로 생각된다.
- 인슐린에 의한 세포내 신호전달에 있어서 인슐린의 효과를 저해하는 PTP1B의 활성을 측정한 결과, PL은 10, 30, 100 μg/mL에서 통계적으로 P<0.05 수준에서의 유의한 저해효과가 나타났으며 PL 1,000 μg/mL에 있어서는 P<0.01 수준에서 유의한 저해효과가 나타났다.
- 지방축적 억제 효과를 확인하기 위하여 분화유도 후 8일째에 Oil Red O 염색을 통해 세포 내 형성된 lipid droplet을 isopropanol에 용출하여 500 nm에서 흡광도를 측정한 결과 PL 3, 30, 100, 300 μg/mL에서 P<0.01 수준에서 유의한 억제 효과가 나타났다.
- 고지방식이를 섭취하고 28일간의 체중변화량을 Table 2에 나타내었다. 체중변화는 실험 시작 시에 정상군(Normal)과 고지방식이대조군 간의 차이가 없었으나, 실험 종료시 정상군보다 고지방 대조군이 높은 체중증가율을 보여 고지방식이로 비만이 유도되었음을 확인하였다(Data not shown). 고지방식이대조군(HFD)에 비해 PL과 PLM 투여군이 감소하는 경향은 보였으나 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 혈청의 HDL-cholesterol은 HFD처리군보다 시료처리군에서 증가를 보였으며, PLM처리군에서 유의적인 증가를 나타내었다(P<0.01).
- 혈청의 총콜레스테롤은 HFD군(92.0±10.8 mg/dL)에 비해 PL군(69.2±17.4 mg/dL), PLM군(68.8±19.3 mg/dL) 모두 유의적인 감소를 나타내었고(P<0.05), 혈청의 중성지방(triglyceride) 농도는 HFD군 110.0±13.8 mg/dL에 비해 PL군은 82.0±16.2, PLM군은 84.6±10.8 mg/dL로 모두 유의적으로 감소하였다.
후속연구
- 3B). PTP1B 저해물질을 이용한 성인형 비만 및 당뇨병 치료제의 개발에 식물의 새로운 골격을 갖는 저해물질이 발굴되면 이를 출발물질로 새로운 당뇨병 치료제의 개발이 기대되어 현재의 당뇨 치료제 개발에 획기적인 전기를 제공할 수 있다. 따라서 PL, PLM은 체내 조직의 인슐린 신호전달과정에서 탈인산화 작용에 관여하는 PTP1B 효소를 저해함으로써 인슐린의 작용을 높이고 당흡수를 지연시켜, 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 상황버섯과 상황버섯균사체 배양쌀은 지방세포의 분화를 억제시키며 PL과 PLM이 혈청 지질 조정을 개선시키는데 효과가 있음을 알 수 있다. 앞으로 항비만, 항당뇨 생리활성을 나타내는 식품소재로서의 개발에 가능성이 있을 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.