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문제 정의
- 본 연구에서는 한약재로 쓰이고 있는 도꼬마리의 항균, 항암효과를 가진 선행연구 결과를 기반으로 도꼬마리추출물을 특정 유산균으로 발효시킨 후 특성으로 항산화효과와 H. pylori의 생육저해능을 검토하였으며, 특히 다양한 유산균을 이용한 복합배양에 의한 특성을 검토한 결과를 보고하고자 한다.
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도꼬마리 추출물의 유산발효
유산균을 이용한 도꼬마리 추출물의 유산발효는 미발효시의 anti-Helicobactor pylori 활성 (Table 1)보다 우수한 항균성 물질의 생산 등 다양한 기능성 물질의 생산을 목적으로 실험을 시행하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 Lactobacillus 6균주의 단일배양에서는 Lactobacillus brevis KCTC 3498와 Lactobacillus casei KCTC 3109가 미발효 배양액인 control 에 비해 항균활성이 약간 증가하는 경향을 보였으나 대다수가 큰 차이가 없이 유사한 결과를 나타내었다.
제안 방법
- 1 mL용 C18 Sep-Pak cartridge에 배양액 500 μL을 흡착시킨 다음 각각 30%, 50%와 100% methanol로 항균성 물질을 용출시켜 용출액 20 μL로 항균활성을 확인하였다.
- Fig. 3의 결과에서 항균 활성을 가진 30% methanol 용출액 중의 항균성 물질을 TLC로 분석하였다. 용출액 10 μL를 TLC plate에 spotting하고 전개용매는 methylene chloride와 methanol (6：4)을 사용하여 전개하였다.
- Radical 소거능은 Blois의 방법 [19]을 변형한 방법을 이용하여 측정하였다. DPPH는 실험을 시작하기 전 methanol 에 0.
- 검출은 UV lamp를 사용하여 254 nm에서 조사한 후 확인하였다. Silica gel plate상에서 UV로 확인된 spot은 silica gel을 회수하여 전개용매로 추출, 농축하여 항균 활성을 확인하였다.
- 용출액 10 μL를 TLC plate에 spotting하고 전개용매는 methylene chloride와 methanol (6：4)을 사용하여 전개하였다. 검출은 UV lamp(254 nm)를 사용하였으며 항균성 물질의 확인은 검출된 spot 을 회수하여 전개용매로 추출, 농축하여 항균 활성을 확인하였다. Fig.
- 단일배양 및 복합배양 시 각각의 유산균 접종량은 1 × 108 CFU/mL으로 stock액을 제조한 후 배양액에 0.1% (v/v)가되도록 접종 하였으며, 배양은 37℃에서 정치배양 하였다.
- 복합배양의 항균활성을 확인하기 위하여 두 그룹으로 나누어서 실험을 실시하였다. 단일배양에서의 pH 측정결과 (Fig. 1)로부터 유산생산능이 낮은 Lactobacillus균주 (Fig. 1 C, D, F)를 Fig. 1과 동일하게 접종하여 2일간 배양한다음, 유산생산능이 우수한 Lactobacillus균주 (Fig. 1 A, B, E) 를 동량 접종하여 2일간 더 배양한 A 그룹과 Lactobacillus 6균주를 무작위로 2균주 씩 선택하여 배양한 B 그룹으로 나누어 항균 활성을 검토하였다. Fig.
- 도꼬마리 추출물을 농도별로 첨가한 발효액과 2배 희석한 Folin 시약은 1：1의 비율로 혼합하여 실온에서 3분간 반응시킨 후 10% Na2CO3을 2 mL 첨가하여 1시간 반응시키고 UV/Visible spectrophotometer 700 nm에서 측정하였다. 대조구는 tannic acid를 이용하였으며, 각각 농도별로 첨가하여 측정하였다.
- 도꼬마리 추출물의 유산발효에 의한 항균 효과를 비롯한 다양한 기능성 물질의 생산가능성을 검토하기위하여 먼저 배양에 사용할 도꼬마리 추출물의 농도를 검토하였다. 도꼬마리 추출물은 멸균수로 각각 5, 25, 50, 100, 200 mg/mL의 농도로 희석하여 agar diffusion법으로 시험균주인 Helicobactor pylori에 대한 항균 활성을 조사하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 추출물은 5 mg/mL의 농도에서는 항균 활성이 없으나 25 mg/mL이상의 농도에서는 항균 활성을 나타내었다.
- Table 2에서 보는 바와 같이 Lactobacillus 6균주의 단일배양에서는 Lactobacillus brevis KCTC 3498와 Lactobacillus casei KCTC 3109가 미발효 배양액인 control 에 비해 항균활성이 약간 증가하는 경향을 보였으나 대다수가 큰 차이가 없이 유사한 결과를 나타내었다. 도꼬마리 추출물의 단일배양 시 pH는 유산생성으로 인한 항균 효과, Lactobacillus 6균주의 생육활성과 복합배양의 조합을 위하여 측정하였다. 생육 활성이 가장 양호한 배양 3일째 배양액의 pH를 측정한 결과, 도꼬마리 배양액은 Fig.
- 도꼬마리 추출물의 유산균 발효에 의해 생산된 기능성 물질 (항산화능)의 변화를 검토하기 위하여 총 polyphenol 함량을 측정하였다. 도꼬마리 추출물의 단일배양에서 FolinDenis 방법을 응용하여 polyphenol 화합물을 측정한 결과, Fig.
- 도꼬마리 추출물의 유산발효는 유산균을 생육시키기 위하여 lactobacilli MRS배지에 도꼬마리 추출물을 멸균수에 용해 (25 mg/mL)한 추출액을 1：1의 비율로 첨가하였다. 단일배양 및 복합배양 시 각각의 유산균 접종량은 1 × 108 CFU/mL으로 stock액을 제조한 후 배양액에 0.
- 도꼬마리 추출물의 유산발효액으로부터 생산된 항균성 물질의 분리를 위한 예비조작은 TLC를 이용하여 분석하였다. C18 Sep-Pak cartridge (Waters Co.
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유산발효용 도꼬마리 추출물의 농도
도꼬마리 추출물의 유산발효에 의한 항균 효과를 비롯한 다양한 기능성 물질의 생산가능성을 검토하기위하여 먼저 배양에 사용할 도꼬마리 추출물의 농도를 검토하였다. 도꼬마리 추출물은 멸균수로 각각 5, 25, 50, 100, 200 mg/mL의 농도로 희석하여 agar diffusion법으로 시험균주인 Helicobactor pylori에 대한 항균 활성을 조사하였다.
- 1% (v/v)가되도록 접종 하였으며, 배양은 37℃에서 정치배양 하였다. 발효된 도꼬마리 추출물 배양액에서 공시균주의 산 생성여부는 배양일수별로 배양액을 분취하여 10분간 3,000 rpm 에서 원심분리 한 후 상등액의 pH를 측정하여 확인하였다.
- 복합배양의 항균활성을 확인하기 위하여 두 그룹으로 나누어서 실험을 실시하였다. 단일배양에서의 pH 측정결과 (Fig.
- 시험균주는 Brucella broth배지 계대배양하여 4℃에서 보관하여 사용하였으며, 항균 활성은 배양액을 4℃, 3000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액 20 μL를 paper disk (Φ 6 mm, Whatman Co.)에 첨가하여 건조시킨 뒤 시험 균주가 접종된 평판배지 위에 얹고 5% CO2, 37℃에서 2일간 배양하여 inhibitory zone의 유무 및 크기를 통해 판단하였다.
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요약
약용식물인 도꼬마리 추출물을 사용하여 유산균을 이용한 단일 및 복합배양을 통하여 새로운 기능성 물질의 생산을 검토하였다. 도꼬마리 추출물의 유산발효 시 단일배양 결과에서 유산생산을 통해 대체로 잘 증식하는 것이 확인되었으며, H.
- 3 mM이 되도록 녹인 후 사용하였으며, DPPH 용액과 도꼬마리 추출물 발효액을 1：1로 혼합하여 실온에서 30분간 반응 시킨 다음, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조구는 배양액 대신 methanol을 첨가하여 측정하였다.
- 항균성 물질의 분리는 복합배양한 도꼬마리 추출물 발효액을 사용하였으며, 발효액은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 1 mL용 C18 Sep-Pak cartridge (Waters Co.)에 배양액 500 μL을 흡착시키고 증류수 1 mL 로 wash 한 후 각각 30%, 50%와 100% methanol로 항균성 물질을 용출시켜 20 μL를 paper disk (Φ 6 mm, Whatman Co.)에 첨가하고 건조시킨 뒤 항균활성을 확인하였다.
대상 데이터
- delbrueckii subsp. bulgaricus KCTC 3635.
- plantarum KCTC 3108 and Lb. helveticus KCTC 3545.
- Japan)로 농축하여 사용하였다. 발효에 사용한 유산균은 GRAS유산균 [17]을 참고하여 6균주를 선정하여 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행 (KCTC)에서 분양을 받아 사용하였으며, 시험균주로서 Gram 음성 나선 균인 Helicobactor pylori는 계명대학교 동산의료원에서 분양을 받아 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 재료는 경남 ․ 경북 지역의 산야에 자생 하는 Xanthium strumarium L. (한국명: 도꼬마리)을 2008년 10월 중 채취하여 음건, 세절한 후 사용하였다. 도꼬마리 추출액의 조제는 잎과 열매를 각각 50 g 씩 파쇄를 하여 1 L의 methanol에 2일간 추출한 후 Vacuum rotary evaporator (EYELA Co.
- )에 계대배양한 후 균체를 20% glycerol이 포함된 저장액에 넣어 -70℃ 에 넣어 보관하였으며, 실험에 사용하기 전 계대배양을 하여 사용하였다. 시험균주인 Helicobactor pylori는 Brucella broth 배지 (pancreatic digest of casein 10 g, peptic digest of animal tissue 10 g, yeast extract 2 g, dextrose 1 g, sodium chloride 5 g, sodium bisulfite 0.1 g/L, pH 7, BD Co.)에서 4% FBS, 5% CO2, 37℃의 조건에서 계대배양 하여 4℃에서 보관하여 사용하였다.
- 항균성 물질의 분리는 C18 Sep-Pak cartridge를 사용하여 Fig. 2의 복합배양에서 항균 활성이 우수한 두 그룹 (A 및 B) 의 배양액을 사용하였다. 1 mL용 C18 Sep-Pak cartridge에 배양액 500 μL을 흡착시킨 다음 각각 30%, 50%와 100% methanol로 항균성 물질을 용출시켜 용출액 20 μL로 항균활성을 확인하였다.
이론/모형
- Polyphenol 화합물 측정은 polyphenol을 Folin-Denis 방법 [18]을 이용하여 측정하였다. 발효된 도꼬마리 추출물 배양액은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 실험에 사용하였다.
- 도꼬마리 추출물 발효액의 항균 활성은 Gram 음성 나선 균주인 Helicobactor pylori를 사용하여 agar diffusion법으로 측정하였다. 시험균주는 Brucella broth배지 계대배양하여 4℃에서 보관하여 사용하였으며, 항균 활성은 배양액을 4℃, 3000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액 20 μL를 paper disk (Φ 6 mm, Whatman Co.
성능/효과
- DPPH법을 이용한 도꼬마리 유산발효액의 radical 소거 활성은 Fig. 7의 결과에서 보인 바와 같이 단일배양의 경우도꼬마리 추출물 0.1 및 0.5 mg/mL 첨가 시에 미발효시 (25%)에 비해 30∼40%의 scavenging을 확인하였다.
- 1 A, B, E) 를 동량 접종하여 2일간 더 배양한 A 그룹과 Lactobacillus 6균주를 무작위로 2균주 씩 선택하여 배양한 B 그룹으로 나누어 항균 활성을 검토하였다. Fig. 2에서 보인 바와 같이 A 그룹에서는 Lactobacillus brevis KCTC 3498와 Lactobacillus helveticus KCTC 3545의 복합배양 (pH 3.2, 결과 미게재) 에서 항균 효과가 우수하였으며, 무작위로 선택하여 배양한 B 그룹은 Lactobacillus plantarum KCTC 3108과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545의 복합배양 (pH 3.5, 결과 미게재) 에서 항균 활성이 우수하였다. 이 결과는 단일배양 (Table 2) 의 경우 항균 효과가 미약하였으나 (inhibitory zone: 12 mm), 복합배양에서는 A 및 B 그룹 중 두 종류의 복합배양에서 control에 비해 강한 항균 활성 (A: 20.
- 검출은 UV lamp(254 nm)를 사용하였으며 항균성 물질의 확인은 검출된 spot 을 회수하여 전개용매로 추출, 농축하여 항균 활성을 확인하였다. Fig. 4에서 보인 바와 같이 a, b 모두 Rf 0.46의 위치에서 spot이 확인되었으며, 이들 spot을 회수하여 항균 활성을 검토한 결과 Helicobactor pylori에 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
- 도꼬마리 유산발효액의 항산화활성은 총 polyphenol 함량 및 radical 소거능을 검토하였으며, 그 결과 총 polyphenol 함량은 미발효시에 비해 도꼬마리 추출물의 저농도에서 단일배양의 경우 2∼4배 증가하였으며, Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우 1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다. Radical 소거능은 도꼬마리 추출물을 0.1 및 0.5 mg/mL로 첨가하여 발효하였을 때 30∼40%의 scavenging이 확인되어 발효를 하지 않았을 때 (25%)보다 발효를 하였을 때 높아지는 것으로 나타났다. 특히 Lactobacillus casei KCTC 3109의 경우 0.
- 그 중 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus KCTC 3635가 높은 pH를 나타내었으며, 내산성인 Helicobactor pylori에 대한 항균활성은 유산에 의한 결과가 아닌 것으로 사료되었다.
- 도꼬마리 유산발효액의 항산화활성은 총 polyphenol 함량 및 radical 소거능을 검토하였으며, 그 결과 총 polyphenol 함량은 미발효시에 비해 도꼬마리 추출물의 저농도에서 단일배양의 경우 2∼4배 증가하였으며, Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우 1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다.
- 도꼬마리 추출물의 단일배양에서 FolinDenis 방법을 응용하여 polyphenol 화합물을 측정한 결과, Fig. 5에서 보인 바와 같이 항균 활성 (Table 2)과는 달리 저농도 (0.5 및 1 mg/mL)의 도꼬마리 추출물을 첨가한 유산 발효 시에 미발효한 추출물에 비해 2∼4배의 polyphenol이 생산된 결과를 확인하였다.
- 특히 Lactobacillus fermentum KCTC 3112로 발효한 도꼬마리 추출물의 polyphenol은 가장 높은 생산성을 나타내었다. 도꼬마리 추출물의 복합배양에서 polyphenol 생산은 Fig. 6에서 보인 바와 같이 단일배양 (Fig. 5)에서와 마찬가지로 도꼬마리 추출물 0.5 mg/mL 와 1 mg/mL의 농도에서 추출물에 비해 생산량이 증가하였으며, 특히 A그룹 중 Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다. 이들 결과에서 유산균을 이용하여 복합배양을 함으로써 도꼬마리 추출물의 polyphenol 함량이 발효하지 않았을 때보다 크게 증가한다고 사료되었다.
- 약용식물인 도꼬마리 추출물을 사용하여 유산균을 이용한 단일 및 복합배양을 통하여 새로운 기능성 물질의 생산을 검토하였다. 도꼬마리 추출물의 유산발효 시 단일배양 결과에서 유산생산을 통해 대체로 잘 증식하는 것이 확인되었으며, H. pylori의 항균 활성은 단일배양보다 복합배양 시 항균활성이 아주 우수하였다. 항균성 물질의 분리는 C18 Seppak cartridge에 흡착시켜 30% methanol 용출획분에서 항균성물질이 확인되었으며, TLC로 분석한 결과 Rf 0.
- 생육 활성이 가장 양호한 배양 3일째 배양액의 pH를 측정한 결과, 도꼬마리 배양액은 Fig. 1에서 보인 바와 같이 미발효 배지인 control에 비해 대다수의 pH가 3.5∼4.0으로 낮아져서 유산을 생산하며 생육이 양호함을 확인하였다.
- 5, 결과 미게재) 에서 항균 활성이 우수하였다. 이 결과는 단일배양 (Table 2) 의 경우 항균 효과가 미약하였으나 (inhibitory zone: 12 mm), 복합배양에서는 A 및 B 그룹 중 두 종류의 복합배양에서 control에 비해 강한 항균 활성 (A: 20.5 mm, B: 20 mm)을보였다. 특히 A 그룹의 Lactobacillus brevis KCTC 3498와 Lactobacillus helveticus KCTC 3545의 복합배양은 단일배양에서의 항균 활성이 가장 우수한 균주간의 배양이며, 이들 유산균주의 복합배양 시 다양한 항균성 물질의 생산에 의해 항균 활성이 증대된다고 사료되었다.
- 3에서 보인바와 같이 30% methanol 에서 항균 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이 결과로 인해 도꼬마리 복합배양액의 항균성 물질은 친수성이 강한 물질로 추정되었다.
- 1 mg/mL의 농도에서 70%의 scavenging을 나타내었다. 이들 결과로부터 도꼬마리 추출물의 유산발효는 미발효시에 비해 Helicobactor pylori에 대한 항균활성물질의 생산과 기능성물질인 항산화물질의 생산성이 우수하다고 사료되었으며 천연한약재의 발효를 통한 천연물 신약 등 신기능물질의 생산가능성을 확인하였다.
- 5 mg/mL 와 1 mg/mL의 농도에서 추출물에 비해 생산량이 증가하였으며, 특히 A그룹 중 Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다. 이들 결과에서 유산균을 이용하여 복합배양을 함으로써 도꼬마리 추출물의 polyphenol 함량이 발효하지 않았을 때보다 크게 증가한다고 사료되었다.
- 5 mm, B: 20 mm)을보였다. 특히 A 그룹의 Lactobacillus brevis KCTC 3498와 Lactobacillus helveticus KCTC 3545의 복합배양은 단일배양에서의 항균 활성이 가장 우수한 균주간의 배양이며, 이들 유산균주의 복합배양 시 다양한 항균성 물질의 생산에 의해 항균 활성이 증대된다고 사료되었다.
- 5 및 1 mg/mL)의 도꼬마리 추출물을 첨가한 유산 발효 시에 미발효한 추출물에 비해 2∼4배의 polyphenol이 생산된 결과를 확인하였다. 특히 Lactobacillus fermentum KCTC 3112로 발효한 도꼬마리 추출물의 polyphenol은 가장 높은 생산성을 나타내었다. 도꼬마리 추출물의 복합배양에서 polyphenol 생산은 Fig.
- pylori의 항균 활성은 단일배양보다 복합배양 시 항균활성이 아주 우수하였다. 항균성 물질의 분리는 C18 Seppak cartridge에 흡착시켜 30% methanol 용출획분에서 항균성물질이 확인되었으며, TLC로 분석한 결과 Rf 0.46의 위치에서 항균성 물질을 확인하였다. 도꼬마리 유산발효액의 항산화활성은 총 polyphenol 함량 및 radical 소거능을 검토하였으며, 그 결과 총 polyphenol 함량은 미발효시에 비해 도꼬마리 추출물의 저농도에서 단일배양의 경우 2∼4배 증가하였으며, Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우 1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다.
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