피부의 노화는 유전자 돌연변이와 같은 유전적인 요소와 자외선 노출과 같은 환경적인 요소와 연관되어 있다. 이러한 요소들은 교원질과 탄력섬유와 같은 피부의 구조적인 복합체를 분해한다. 특히, 교원질은 전사인자인 AP-1에 의해 유도되는 분해효소인 MMP-1에 의해 분해되고 그 결과 피부의 주름이 발생한다. 교원질의 다른 분해 원인으로는 생체내활성산소의 생성을 들 수 있다. 활성산소의 생성은 세포막을 공격하고 MMP-1의 활성을 유도한다. 결과적으로, 피부 탄력의 감소와 동시에 피부의 노화를 촉진시키게 된다. 본 연구에서 우리는 양조 부산물인 주박을 이용하여 항산화효과, collagen 합성촉진효과, MMP-1의 발현양상을 측정하였다. 흥미롭게도, 주박은 DPPH 라디컬의 소거활성 효과와 procollagen의 양을 증가시킴과 동시에, MMP-1의 유전자 발현을 억제시키는 효과를 나타내었다. 본 결과는 주박이 피부의 항노화 효과를 가질 수 있다는 것을 제시한다.
피부의 노화는 유전자 돌연변이와 같은 유전적인 요소와 자외선 노출과 같은 환경적인 요소와 연관되어 있다. 이러한 요소들은 교원질과 탄력섬유와 같은 피부의 구조적인 복합체를 분해한다. 특히, 교원질은 전사인자인 AP-1에 의해 유도되는 분해효소인 MMP-1에 의해 분해되고 그 결과 피부의 주름이 발생한다. 교원질의 다른 분해 원인으로는 생체내 활성산소의 생성을 들 수 있다. 활성산소의 생성은 세포막을 공격하고 MMP-1의 활성을 유도한다. 결과적으로, 피부 탄력의 감소와 동시에 피부의 노화를 촉진시키게 된다. 본 연구에서 우리는 양조 부산물인 주박을 이용하여 항산화효과, collagen 합성촉진효과, MMP-1의 발현양상을 측정하였다. 흥미롭게도, 주박은 DPPH 라디컬의 소거활성 효과와 procollagen의 양을 증가시킴과 동시에, MMP-1의 유전자 발현을 억제시키는 효과를 나타내었다. 본 결과는 주박이 피부의 항노화 효과를 가질 수 있다는 것을 제시한다.
Skin aging is related to genetic and environmental factors (e.g., gene mutation and UV radiation respectively). To develop a new anti-wrinkle cosmetic or functional food by using Korean rice wine cake, we examined the effects of Korean rice wine cake, a brewery byproduct, on antioxidant effect, coll...
Skin aging is related to genetic and environmental factors (e.g., gene mutation and UV radiation respectively). To develop a new anti-wrinkle cosmetic or functional food by using Korean rice wine cake, we examined the effects of Korean rice wine cake, a brewery byproduct, on antioxidant effect, collagen synthesis and expression of MMP-1. Interestingly, we found that Korean rice wine cake has the ability to promote scavenging activity of DPPH radical. We also found that the cell proliferation and synthesis of collagen in HS27 cells was increased by Korean rice wine cake in a concentration-dependent manner. However, elastase inhibitory activity was not changed. In addition, the expression of MMP-1 was inhibited by Korean rice wine cake in a concentration-dependent manner. All these results suggest that Korean rice wine cake can be effectively used for the prevention of wrinkles in human skin.
Skin aging is related to genetic and environmental factors (e.g., gene mutation and UV radiation respectively). To develop a new anti-wrinkle cosmetic or functional food by using Korean rice wine cake, we examined the effects of Korean rice wine cake, a brewery byproduct, on antioxidant effect, collagen synthesis and expression of MMP-1. Interestingly, we found that Korean rice wine cake has the ability to promote scavenging activity of DPPH radical. We also found that the cell proliferation and synthesis of collagen in HS27 cells was increased by Korean rice wine cake in a concentration-dependent manner. However, elastase inhibitory activity was not changed. In addition, the expression of MMP-1 was inhibited by Korean rice wine cake in a concentration-dependent manner. All these results suggest that Korean rice wine cake can be effectively used for the prevention of wrinkles in human skin.
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문제 정의
마지막으로 RT-PCR을 이용한 collagen의 직접적인 분해인자인 MMP-1의 mRNA level에서의 발현을 측정했을 때, 농도의존적 억제의 결과를 확인 할수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해서 주박은 피부의 주름 예방 및 완화할 수 있는 효과를 입증하였고, 주박을 이용한 피부주름 개선을 위한 천연소재로서의 가능성을 입증하였다.
본 연구는 양조 부산물인 주박이 피부의 주름억제 즉, 피부의 항노화 효과를 알아보기 위해 진행하였다. 그 결과 주박은 항산화 활성 효능에서 약 40-43% radical 소거능을 보임으로써 항산화 활성의 효과를 나타내었다.
이에 본 연구는, 피부 섬유아세포를 이용하여 주박이 피부에 미치는 항노화 효과에 관한 연구를 수행하였고, 피부노화의 직접적인 원인인 MMP-1의 유전자 발현과 피부의 주요 구성인자인 콜라겐의 생합성 촉진 효과에 대해 검증하였고, 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
HS27세포에 주박을 농도별로 처리했을 때 collagen type I의 합성양을 측정하기 위해 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit를 이용하였다. 96-well plate에 각 well당 10,000세포가 되도록 심어준 후 24시간을 배양하였다.
추출된 total RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하여, 1μg의 RNA를 이용하였고, cDNA 합성 및 PCR은 Accupower RT/PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분씩 22 cycles 수행하였고, PCR 산물은 2% agarose gel로 전기영동을 한 후, ethidium bromide을 첨가하여 밴드를 가시화하였다. 사용된 primer는 다음과 같다.
배지를 제거하고, phosphate-buffered saline (PBS)로 두 번 헹구어준 뒤, 주박을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. Total RNA는 TRI Reagent (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 제조사의 방법으로 추출하였다. 추출된 total RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하여, 1μg의 RNA를 이용하였고, cDNA 합성 및 PCR은 Accupower RT/PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
이 후, 배양된 배지를 제거하고 주박을 농도별로 처리한 후 24시간을 배양하였다. 각 well로부터 상층액을 회수하여 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit의 각 well에 첨가한 후, 제조사의 방법에 따라 procollagen type I의 총 양을 측정하였다.
MMP-1은 type I collagenase 로도 불리며, 세포외기질을 분해할 뿐만 아니라 특이적으로 type I procollagen을 분해함으로써 collagen의 합성을 억제하는 분해인자로 알려져 있다[7,10,14,20]. 그러므로, MMP-1 활성의 억제는 곧 collagen 분해를 감소시켜 피부탄력의 유지 및 주름형성을 억제 할 수 있으리라 판단되어 mRNA level에서의 MMP-1 유전자의 발현 변화를 측정하였다(Fig. 5). 그 결과, 섬유아세포에 처리된 주박의 농도가 증가할수록 비처리군에 비해 MMP-1의 유전자 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 elastase의 활성은 기질 단백질을 분해시켜 피부의 세포기저 층의 그물망 구조를 끊어줌으로써 주름을 유발하는 주원인 효소로 이상조직에서는 그 활성이 높아져 직접적으로 조직을 파괴하여 피부의 주름을 유발하게 된다[2,9]. 따라서, elastase의 활성 억제 효과를 확인하기 위해 Tris-HCl과 혼합된 다양한 농도의 주박을 elastase 효소와 기질을 결합하여 elastase의 활성 억제현상을 측정하였다(Fig. 3). 주박을 처리하지 않은 비처리군의 elastase의 활성과 비교하였을 때, 농도별로 처리된 주박 처리군은 비처리군과 마찬가지로 활성의 억제 효과를 나타내지 않았다.
주박의 세포 증식 효과는 Ez-cytox enhanced cell viability kit (Daeil Lab, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 각 well당 2,500세포가 되도록 심어준 후, 24시간을 배양하였다.
주박의 탄력섬유 분해효소의 억제효과를 알아보기 위해 elastase를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.
주박의 항산화 효과는 DPPH를 이용하여 라디컬 소거효과를 측정하였다. 0.
주박의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 그 소거능을 확인하였다(Fig. 1). 농도별로 처리된 주박의 경우 250 μg/ml에서 43%의 free radical 소거활성을, 500 μg/ml에서 40%의 소거활성을 나타내었다.
추출된 total RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하여, 1μg의 RNA를 이용하였고, cDNA 합성 및 PCR은 Accupower RT/PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
피부 섬유아세포에서 주박의 처리가 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Ez-cytox enhanced cell viability kit를 이용하여 세포 증식 효과를 조사하였다. Fig.
대상 데이터
Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Fetal Bovine Serum (FBS) 과 penicillin-streptomycin은 Lonza (Walkersville, MD, USA) 에서 구입하였다. Collagen의 생합성 양을 측정하기 위해서 사용한 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit는 TAKARA Bio Inc. (Shiga, Japan)에서 구입하여 실험을 하였다.
HS27세포는 100 mm-culture dish에 70%가 될 때까지 배양 하였다. 배지를 제거하고, phosphate-buffered saline (PBS)로 두 번 헹구어준 뒤, 주박을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
세포 배양을 위한 배양액인 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Fetal Bovine Serum (FBS) 과 penicillin-streptomycin은 Lonza (Walkersville, MD, USA) 에서 구입하였다.
인간 섬유아세포인 HS27세포는 정해영 교수(부산대학교) 로부터 분양 받았으며, 10% FBS와 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에서 2-3일마다 배양액을 교환해 주었으며, 배양 환경은 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 평균±표준편차(means±SEM)로 나타내었다.
통계처리는 Dunnett’s test로 검정하였고 정상 대조군과 비교하여 <0.05 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.
성능/효과
Fig. 4의 결과에서 섬유아세포에 주박을 다양한 농도로 처리했을 때, 농도의존적으로 procollagen의 양이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 비처리군의 procollagen의 양을 100%로 했을 때 주박의 최대농도 처리군인 500 μg/ml의 농도에서 42.5% 증가함을 확인할 수 있었다.
본 연구는 양조 부산물인 주박이 피부의 주름억제 즉, 피부의 항노화 효과를 알아보기 위해 진행하였다. 그 결과 주박은 항산화 활성 효능에서 약 40-43% radical 소거능을 보임으로써 항산화 활성의 효과를 나타내었다. 또한, 주박은 세포의 증식 및 피부의 구성인자인 collagen의 합성을 촉진하는 것을 알 수 있었다.
5). 그 결과, 섬유아세포에 처리된 주박의 농도가 증가할수록 비처리군에 비해 MMP-1의 유전자 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 조직 특이적 억제자로 알려진 TIMP는 특이적으로 MMPs를 불활성화 시켜 생물학적으로 평형상태를 유지시킨다고 알려져 있다[1].
그러나 본 연구 결과에서 collagen 분해효소 억제 유전자로 알려진 TIMP-1의 유전자 발현에는 영향이 없었다. 따라서, 주박은 collagen의 직접적인 분해요소인 MMP-1의 발현을 mRNA level에서 억제함으로써, 피부 주름의 형성을 억제하는 것으로 판단되고, 이는 주박을 이용한 피부주름개선 화장품의 개발의 가능성을 제시한다. 그러나, 정확한 주박의 피부개선 분자기작에 대한 연구는 미흡하며, 앞으로 구체적인 관련 연구가 더 진행되어야 할 것 이다.
주박을 처리하지 않은 비처리군의 elastase의 활성과 비교하였을 때, 농도별로 처리된 주박 처리군은 비처리군과 마찬가지로 활성의 억제 효과를 나타내지 않았다. 따라서, 주박의 효과는 elastase의 활성 억제기작에는 연관이 없음을 알 수 있었다.
그 결과 주박은 항산화 활성 효능에서 약 40-43% radical 소거능을 보임으로써 항산화 활성의 효과를 나타내었다. 또한, 주박은 세포의 증식 및 피부의 구성인자인 collagen의 합성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 세포 증식의 경우 주박의 비처리군에 비해 약 26%의 증식율을 보였고, collagen 합성의 경우 비처리군에 비해 약 42.
5%의 증가를 나타내었다. 마지막으로 RT-PCR을 이용한 collagen의 직접적인 분해인자인 MMP-1의 mRNA level에서의 발현을 측정했을 때, 농도의존적 억제의 결과를 확인 할수 있었다. 따라서, 본 연구를 통해서 주박은 피부의 주름 예방 및 완화할 수 있는 효과를 입증하였고, 주박을 이용한 피부주름 개선을 위한 천연소재로서의 가능성을 입증하였다.
농도별로 처리된 주박의 경우 250 μg/ml에서 43%의 free radical 소거활성을, 500 μg/ml에서 40%의 소거활성을 나타내었다. 본 결과로부터 주박은 DPPH radical의 소거 효과가 있는 것을 확인하였다.
또한, 주박은 세포의 증식 및 피부의 구성인자인 collagen의 합성을 촉진하는 것을 알 수 있었다. 세포 증식의 경우 주박의 비처리군에 비해 약 26%의 증식율을 보였고, collagen 합성의 경우 비처리군에 비해 약 42.5%의 증가를 나타내었다. 마지막으로 RT-PCR을 이용한 collagen의 직접적인 분해인자인 MMP-1의 mRNA level에서의 발현을 측정했을 때, 농도의존적 억제의 결과를 확인 할수 있었다.
2의 결과에서, 주박의 처리에 의해 피부 섬유아세포가 농도의존적으로 증가함을 알 수 있었다. 즉, 피부 섬유아세포에 처리된 주박은 세포의 독성이 없다는 것과 동시에 세포의 증식을 유도하는 것을 확인하였고, 궁극적으로는 피부세포의 분화 및 재생에 관여되는 것으로 판단할 수 있었다.
후속연구
따라서, 주박은 collagen의 직접적인 분해요소인 MMP-1의 발현을 mRNA level에서 억제함으로써, 피부 주름의 형성을 억제하는 것으로 판단되고, 이는 주박을 이용한 피부주름개선 화장품의 개발의 가능성을 제시한다. 그러나, 정확한 주박의 피부개선 분자기작에 대한 연구는 미흡하며, 앞으로 구체적인 관련 연구가 더 진행되어야 할 것 이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Collagen는 어떤 특성으로 인해, 외부 자극에 대해 피부를 보호하고 유지시킬 수 있는가?
노화된 피부의 대표적인 증상은 탄력저하에 의해 유발된 잔주름 및 주름의 발생이며, 이는 피부 진피조직의 교원질에서 피부 탄력과 관련된 collagen 단백질의 현저한 감소에 의해서 발생될 수 있다. Collagen은 진피의 90% 이상을 차지하고 있으면서 피부의 장력과 강도를 부여하기 때문에 외부로부터의 자극에 대해 피부를 보호하고 유지시킨다. 그렇기 때문에 collagen의 감소는 피부노화 및 주름생성과 매우 깊은 관계를 가지고 있다[16].
내인성 노화는 무엇인가?
피부 노화(skin aging)는 피부세포 및 조직의 구조적, 기능 적인 변화로 인한 현상으로, 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분된다. 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 생기는 변화로 유전적 요인이 가미된 피부 주름의 발생을 의미하고, 외인성 노화의 경우는 자외선, 중력, 오염된 공기와 같은 환경적 요인에 의한 피부주름의 발생을 의미한다[15,19,21]. 내인성 노화와 외인성 노화는 모두 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데[3-4,15,22], 그 구성요소중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen) 양의 감소가 피부의 주름을 야기한다[6].
내인성 노화나 외인성 노화와 같은 피부 노화는, 어떻게 발생하는 것인가?
내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 생기는 변화로 유전적 요인이 가미된 피부 주름의 발생을 의미하고, 외인성 노화의 경우는 자외선, 중력, 오염된 공기와 같은 환경적 요인에 의한 피부주름의 발생을 의미한다[15,19,21]. 내인성 노화와 외인성 노화는 모두 피부 진피층에 존재하는 세포외기질(extracellular matrix)의 구조적인 변화로 발생되는데[3-4,15,22], 그 구성요소중 탄력섬유(elastic fiber)의 변성과 교원질(collagen) 양의 감소가 피부의 주름을 야기한다[6].
참고문헌 (23)
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