본 연구에서는 한방이화주의 피부 생리기능 활성을 알아보기 위해 70% EtOH 추출물의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증 효과를 조사하였다. HEE은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. HEE은 피부 진피 내 피부 탄력을 유지하는 elastin을 분해하는 효소인 elastase의 활성을 저해하였고, 피부의 keratinocyte가 생성 분비하는 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현과 proteolytic 활성을 억제하여 노화에 따른 피부 주름 생성 억제할 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한 세포 독성 없이 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 50% 저해하는 HEE의 농도($IC_{50}$)는 $24.9{\mu}g/mL$이며, $50{\mu}g/mL$ 농도로 처리하였을 때 염증 반응 저해 효과가 70%로 높은 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 HEE의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 한방이화주의 피부 생리기능 활성을 알아보기 위해 70% EtOH 추출물의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증 효과를 조사하였다. HEE은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. HEE은 피부 진피 내 피부 탄력을 유지하는 elastin을 분해하는 효소인 elastase의 활성을 저해하였고, 피부의 keratinocyte가 생성 분비하는 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현과 proteolytic 활성을 억제하여 노화에 따른 피부 주름 생성 억제할 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한 세포 독성 없이 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 50% 저해하는 HEE의 농도($IC_{50}$)는 $24.9{\mu}g/mL$이며, $50{\mu}g/mL$ 농도로 처리하였을 때 염증 반응 저해 효과가 70%로 높은 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 HEE의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
Extrinsic skin aging is characterized by the loss of skin tone and resilience, irregular pigmentation, and deep wrinkles. The aim of this study was to investigate the effects of Ehwa Makgeolli containing oriental herbs (Glycyrrhiza uralensis Fisch., Lycium chinense MILL., Morus alba L., and Saururus...
Extrinsic skin aging is characterized by the loss of skin tone and resilience, irregular pigmentation, and deep wrinkles. The aim of this study was to investigate the effects of Ehwa Makgeolli containing oriental herbs (Glycyrrhiza uralensis Fisch., Lycium chinense MILL., Morus alba L., and Saururus chinensis Baill) on skin whitening and wrinkling in human skin cells. We prepared Makgeolli extracts (HEE) with 70% ethanol. HEE significantly inhibited in vitro mushroom tyrosinase activity and reduced the cellular and secreted melanin content of mouse melanoma melanocytes (B16F1 cells). HEE down-regulated the protein expression of tyrosinase related protein (TRP)-1/-2, a key player in melanogenesis. Treatment with HEE in human keratinoctyes (HaCaT cells) inhibited the proteolytic activities of matrix metalloproteinase (MMP)-2/-9 in a dose-dependent manner and dramatically reduced the expression of MMP-2/-9. In addition, HEE attenuated lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide production in murine macrophages (RAW264.7 cells). These results indicate that HEE may be a great cosmeceutical ingredient for its whitening, anti-wrinkle, and anti-inflammatory effects.
Extrinsic skin aging is characterized by the loss of skin tone and resilience, irregular pigmentation, and deep wrinkles. The aim of this study was to investigate the effects of Ehwa Makgeolli containing oriental herbs (Glycyrrhiza uralensis Fisch., Lycium chinense MILL., Morus alba L., and Saururus chinensis Baill) on skin whitening and wrinkling in human skin cells. We prepared Makgeolli extracts (HEE) with 70% ethanol. HEE significantly inhibited in vitro mushroom tyrosinase activity and reduced the cellular and secreted melanin content of mouse melanoma melanocytes (B16F1 cells). HEE down-regulated the protein expression of tyrosinase related protein (TRP)-1/-2, a key player in melanogenesis. Treatment with HEE in human keratinoctyes (HaCaT cells) inhibited the proteolytic activities of matrix metalloproteinase (MMP)-2/-9 in a dose-dependent manner and dramatically reduced the expression of MMP-2/-9. In addition, HEE attenuated lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide production in murine macrophages (RAW264.7 cells). These results indicate that HEE may be a great cosmeceutical ingredient for its whitening, anti-wrinkle, and anti-inflammatory effects.
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문제 정의
이화주를 빚을 때 사용하는 쌀누룩(이화누룩) 대한 피부 기능활성을 평가한 결과, 다른 전통누룩 및 일본식 코지에 비해 우수한 피부 미백 효과와 피부 광노화를 억제하는 활성을 확인하였다(14). 고려시대부터 전해져 온 이화주의 발효 과정에 피부 미백 효과가 우수한 4가지 약재인 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)(15), 구기자(Lycium chinense MILL.)(16), 상백피(Morus alba L.)(17)와 삼백초(Saururus chinensis Baill)(18)를 첨가하여 피부 미백 활성이 증가된 한방이화주(한방막걸리)를 개발하였으며, 용매 추출을 통해 한방이화주 추출물을 제조하여 본 연구에 사용하였고 피부 세포에서 한방이화주의 피부 미백과 주름 개선 활성에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
LPS는 세균내독소로 대식세포에 처리하면 염증성 cytokines 및 NO와 같은 염증반응의 매개물질을 생성하여 병리학적 반응이 일어나게 된다(29). 본 연구는 HEE 처리가 RAW264.7 세포의 NO 생성에 어떠한 영향을 미치는지를 평가하고자 수행하였다. RAW264.
본 연구에서는 한방이화주의 피부 생리기능 활성을 알아보기 위해 70% EtOH 추출물의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증 효과를 조사하였다. HEE은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다.
48시간이 지난 다음 배지를 수거하여 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 수행하였다. Bradford법을 이용하여 단백질의 양을 정량하여 10% SDSPAGE(1 mg/mL gelatin 함유)에서 전기영동 수행 후, 0.1% triton-X로 30분씩 2번 세척한 다음 developing buffer를 넣어 30℃에서 18시간 동안 반응시키고 coomassie blue로 염색을 하여 관찰하였다.
따라서 elastase를 저해하는 활성을 가지고 있다는 것은 피부 주름 개선 활성이 있는 것으로 볼 수 있다. HEE가 피부 각질층의 elastin을 분해하여 피부의 탄력성을 소실시켜 피부의 노화를 일으키는 elastase 저해활성을 측정하였다(Fig. 4). HEE의 농도 증가에 따라 elastase 저해활성이 증가하였다.
RAW264.7 세포에 LPS(1 μg/mL) 단독처리 또는 LPS와 HEE 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 동시에 처리한 후, HEE 에 의한 NO 생성 저해 효과를 관찰하였다.
Tyrosinase 저해활성 측정은 No 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 반응구는 0.
마우스 유래 멜라노사이트(murine melanoma melanocyte, B16F1 cells)에 α-MSH 와 HEE를 동시에 처리한 후 세포 내 멜라닌 양을 측정하였으며 대조구로 arbutin을 사용하였다.
단백질 20 mg을 10% SDS-PAGE에 전기영동을 수행하고 gel의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후 5% non-fat milk으로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고 primary antibody(MMP2, MMP-9, TRP-1, TRP-2)를 가하여 4℃에서 overnight 시켰다. 마지막으로 PVDF membrane을 0.1% TBST로 세척하고 secondary antibody conjugated HRP를 희석하여 상온에서 1시간 동안 교반하고 enhanced chemiluminescence detection kit(Amersham Bioscience, Pittsburg, PA, USA)를 사용하여 단백질을 확인하였다.
피부의 keratinocyte, fibroblast를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMPs를 분비한다(25). 먼저 HEE가 keratinocyte가 분비하는 MMP2와 MMP-9에 미치는 영향을 zymography로 평가하였다. HEE는 MMP-2와 MMP-9의 효소적 활성을 농도 의존적으로 저해하였으며(Fig.
Melanin은 tyrosine이 tyrosinase에 의해 DOPA로 전환되는 과정을 시작으로 DOPAquinone, DOPAchrome의 과정을 거쳐 melanin으로 합성된다(21). 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트를 이용하여 HEE가 멜라닌 형성에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 살펴보았다. 마우스 유래 멜라노사이트(murine melanoma melanocyte, B16F1 cells)에 α-MSH 와 HEE를 동시에 처리한 후 세포 내 멜라닌 양을 측정하였으며 대조구로 arbutin을 사용하였다.
cells/ mL로 분주하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 농도별로 시료를 처리하였다. 48시간이 지난 다음 배지를 수거하여 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 수행하였다.
본 연구에 사용된 시료는 70% 에탄올에 한방이화주를 24시간 동안 저온에서 교반하여 1차 추출하였다. 추출 후 에탄올을 모두 제거하고, 한방 이화주 고형분에 70% 에탄올을 재 첨가하여 2차 추출을 진행하였다.
이후 각 well은 PBS를 이용하여 세척 후 FBS-free RPMI 1640 배지를 이용하여 HEE를 1 μg/mL LPS(lipopolysaccharide)와 함께 처리하여 24시간 배양 후 nitric oxide(NO) 생성량을 측정하였다.
본 연구에 사용된 시료는 70% 에탄올에 한방이화주를 24시간 동안 저온에서 교반하여 1차 추출하였다. 추출 후 에탄올을 모두 제거하고, 한방 이화주 고형분에 70% 에탄올을 재 첨가하여 2차 추출을 진행하였다. 한방이화주 에탄올 추출물(HEE)을 수득하고, 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거한 후 동결건조 하였다.
추출 후 에탄올을 모두 제거하고, 한방 이화주 고형분에 70% 에탄올을 재 첨가하여 2차 추출을 진행하였다. 한방이화주 에탄올 추출물(HEE)을 수득하고, 감압농축기를 이용하여 에탄올을 제거한 후 동결건조 하였다.
한방이화주는 생쌀을 분쇄하여 이화누룩(구형의 전통 쌀누룩)과 물을 혼합한 후 20～25℃에서 약 10일간 발효한 후 다시 분쇄한 생쌀, 이화곡과 물 그리고 4가지 약재(감초, 구기자, 상백피 그리고 삼백초)를 혼합하여 25℃에서 25～30일간 발효하였다. 알코올 발효가 종료되면 술지게미를 분리하여 한방 이화주를 완성하였다.
Mouse melanoma melanocyte(B16F1 cells), human fibroblast(HS68 cells), human keratinocyte(HaCaT cells)는 경희대학교 김대옥 교수가 제공해주셨으며, murine macrophage(RAW264.7 cells)는 성균관대학교 조재열 교수가 제공해 준 세포를 사용하였다. B16F1, HS68, HaCaT 세포는 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, RAW264.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복실험을 실시하였으며 각 시료들의 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고 각 실험결과의 통계적 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student's t-test에 의하여 판정하였으며 p값이 0.05미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
HEE의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 먼저 세포를 96-well plate에 2×105 cells/well이 되도록 분주하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 18시간 배양하였다.
cells/mL가 되도록 60 mm cell culture dish에 분주하여 24시간 배양 후 HEE를 처리하고 24시간을 반응시켰다. 세포를 회수하여 lysis buffer를 첨가하여 얻은 단백질을 bradford법을 이용하여 정량하였다. 단백질 20 mg을 10% SDS-PAGE에 전기영동을 수행하고 gel의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동시킨 후 5% non-fat milk으로 상온에서 1시간 동안 blocking 하고 primary antibody(MMP2, MMP-9, TRP-1, TRP-2)를 가하여 4℃에서 overnight 시켰다.
성능/효과
먼저 HEE가 keratinocyte가 분비하는 MMP2와 MMP-9에 미치는 영향을 zymography로 평가하였다. HEE는 MMP-2와 MMP-9의 효소적 활성을 농도 의존적으로 저해하였으며(Fig. 5A), western blot analysis를 통해 세포 내 단백질 발현에 미치는 영향을 평가한 결과, HEE는 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현을 농도 의존적으로 저해하였다(Fig. 5B). MMPs의 활성이 증가되면 피부 내 collagen과 같은 구성 단백질을 붕괴시킨다.
MMP는 진피층의 extracellular matrix(ECM) 붕괴에 영향을 미쳐 노화에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(26). HEE는 노화가 진행되면서 피부 탄력을 유지하는 구성단백질 파괴에 관여하는 elastase와 MMPs의 효소 활성과 발현을 저해하는 것을 확인하였다. 이는 HEE이 피부 탄력을 유지하여 노화에 따른 주름 생성을 억제할 수 있는 가능성이 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 한방이화주의 피부 생리기능 활성을 알아보기 위해 70% EtOH 추출물의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증 효과를 조사하였다. HEE은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. HEE은 피부 진피 내 피부 탄력을 유지하는 elastin을 분해하는 효소인 elastase의 활성을 저해하였고, 피부의 keratinocyte가 생성 분비하는 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현과 proteolyti 활성을 억제하여 노화에 따른 피부 주름 생성 억제할 수 있는 가능성을 확인하였다.
HEE은 tyrosinase 활성 억제 및 tyrosine을 기질로 melanin이 형성되는 pathway에 관여하는 주요한 인자인 TRP-1과 TRP-2를 저해하는 작용 기전을 통해 피부 색소침착의 주요 원인 물질인 melanin 생합성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. HEE은 피부 진피 내 피부 탄력을 유지하는 elastin을 분해하는 효소인 elastase의 활성을 저해하였고, 피부의 keratinocyte가 생성 분비하는 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현과 proteolyti 활성을 억제하여 노화에 따른 피부 주름 생성 억제할 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한 세포 독성 없이 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 50% 저해하는 HEE의 농도(IC50)는 24.
7 세포에 LPS(1 μg/mL) 단독처리 또는 LPS와 HEE 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 동시에 처리한 후, HEE 에 의한 NO 생성 저해 효과를 관찰하였다. 그 결과 HEE는 유의적 수준에서 농도 의존적인 경향으로 NO 생성을 저해하는 것으로 관찰하였다(Fig. 6B). LPS에 의해 유도된 염증반응을 50% 저해하는데 요하는 HEE의 농도인 IC50는 24.
농도 50 μg/mL인 HEE에서 20.2%, 100 μg/mL에서 25.3%의 melanin 합성을 억제하였으며, 양성 대조구인 arbutin(100 μg/mL, 18.0%)보다 다소 높은 저해 활성을 확인하였다(Fig. 2B).
또한 세포 독성 없이 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 50% 저해하는 HEE의 농도(IC50)는 24.9μg/mL이며, 50 μg/mL 농도로 처리하였을 때 염증 반응 저해 효과가 70%로 높은 효과를 가지는 것을 확인하였다.
세포독성 실험 결과, LPS 처리하지 않은 조건 하에서 HEE는 최대 100 μg/mL 농도까지 RAW264.7 cells에 세포 독성이 없는 것으로 나타났다(data not shown).
1과 같다. 실험 결과 HEE는 농도 의존적으로 tyrosinase 저해 활성을 나타내었으며 IC50 값은 40.6 mg/mL로 확인되었다. 양성 대조군인 kojic acid의 IC50 값은 18.
2B). 이 연구 결과 HEE가 tyrosinase을 통한 melanin 생합성에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.
특히 대조군과 비교하였을 때 HEE 25 μg/mL 이상 농도에서 TRP-1과 TRP-2의 강력한 저해 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
0 mg/mL이다. 한방이화주에 첨가된 4 종류의 약재(감초, 구기자, 상백피 및 삼백초)가 첨가되지 않은 순수한 이화주 에탄올 추출물은 농도에 상관없이 tyrosinase 저해 활성이 없는 것으로 확인되었다.
후속연구
9μg/mL이며, 50 μg/mL 농도로 처리하였을 때 염증 반응 저해 효과가 70%로 높은 효과를 가지는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하면 HEE의 피부 미백, 주름 개선 및 항염증에 우수한 효과를 나타내고 있으므로 기능성 화장품의 주요한 소재로 이용 가치가 높을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부노화가 진행될수록 어떤 구조 단백질 생성 능력이 감소하는가?
자외선에 의한 피부 노화가 진행되면 멜라닌 증식이 항시적으로 되고 그 결과 기미가 나타난다(3). 이런 노화들이 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 type-1 collagenase의 생합성이 증가하여 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가되면 진피 내 교원 섬유, 탄력섬유, fibronectin 및 laminin과 같은 기질 단백질 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피부 주름생성을 야기한다(4). 최근 연구에 의하면 elastase가 피부 탄력성 섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 한다고 보고되었으며(5), 이러한 elastase의 활성 증가는 피부 탄력섬유를 감소시켜 피부 주름 형성에 기여한다고 알려져 있다 (6).
피부노화의 종류는?
피부노화는 그 요인에 따라 내인적 노화(intrinsic aging)와 외인적 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 내인적 노화는 피부의 구조와 생리적 기능이 나이를 먹으면서 쇠퇴하는 것이며, 외인적 노화는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스에 의해 노화 현상이 나타나는 것이다.
elastase는 피부에 어떤 역할을 하는가?
이런 노화들이 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등 구조 단백질을 생성하는 능력이 감소하고 type-1 collagenase의 생합성이 증가하여 matrix metalloproteinases(MMPs)의 발현이 증가되면 진피 내 교원 섬유, 탄력섬유, fibronectin 및 laminin과 같은 기질 단백질 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피부 주름생성을 야기한다(4). 최근 연구에 의하면 elastase가 피부 탄력성 섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 한다고 보고되었으며(5), 이러한 elastase의 활성 증가는 피부 탄력섬유를 감소시켜 피부 주름 형성에 기여한다고 알려져 있다 (6). 또한 누적되는 산화적 스트레스는 피부 노화를 더 촉진하게 된다(7).
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