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문제 정의
- 본 연구에서는 밀리타리스 동충하초의 열수추출물로부터 멜라닌 분비억제능을 확인함으로서 향후 미백효능을 나타내는 유용 물질을 확보하는 근거를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- 동결건조하여 얻은 열수추출물(CMWE)을 3차 멸균증류수에 녹인 후, 필터(0.45 µm syringe filter)하여 시험에 사용하였다(Fig 1).
- 멜라닌 생성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16세포를 24 well plate에 1 × 105 cells/well이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 안정화하였다.
- 안정화 된 세포에 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml의 농도로 처리하여 7일 배양한 후, 처리된 세포를 1 N NaOH로 cell을 녹여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다.
- 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 in vitro 타이로시나아제 활성 억제율을 측정하기 위하여, 96 well plate에 L-tyrosine (1.5 mM) 40 µl와 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 각각 0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml의 농도로 첨가하고, 타이로시나아제 (2000 unit, Sigma Chemical Co., USA)를 20 µl씩 넣은 후 100 mM 인산완충용액으로 최종 200 µl가 되게 조절하였다.
- 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 미백 작용을 확인하기 위하여 먼저 melanin 생성에 중요한 작용을 하는 타이로시나아제에 직접적인 작용을 관찰하였다. 타이로시나아제는 L-타이노신을 L-DOPA로 전환시키고 이어서 L-DOPA를 L-DOPA 퀴논으로 산화시킨다.
- 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 세포독성을 확인하고자 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 이 방법은 MTT가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 96 well plate에 1 × 104 cells/well의 B16 멜라노마 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후, 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 농도별(0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml)로 24시간 동안 처리하였다.
- 배양액 170 µl 를 제거하고 DMSO 용액 150µl을 첨가하여 생성된 formazan을 용해시킨뒤, Microplate reader (Opsys MR, DYNEX, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도를 측정 하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율 (% of control)을 계산하였다.
- 안정화 된 세포에 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml의 농도로 처리하여 7일 배양한 후, 처리된 세포를 1 N NaOH로 cell을 녹여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 영향을 확인하기 위해 마우스 B16 melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 생성 저해 효과를 측정하였다. 준비된 세포에 열수추출물을 처리하고 7일 후, 흡광도를 이용하여 확인 한 결과 무처리 세포에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었으며, 최고농도인 5000 µg/ml 에서는 멜라닌 생성이 54% 억제됨을 확인하였다(Fig.
- 요약하면, 96 well plate에 100 mM 인산 완충용액 100 µl, 타이로시나아제 (2000 unit, Sigma Chemical Co., USA)를 40 µl와 밀리타리스 동충하초 열수추출물을 각각 0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml의 농도로 첨가하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 마우스에서 유래한 immortalized cell line인 B16 melanoma 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였고, 세포배양은 10% FBS, 100 unit/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 그리고 200 nM TPA (tetradecanoyl phorbol acetate)를 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용된 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)는 김해 청원농산에서 제공받았다. L-tyrosine, L-DOPA, 타이로시나아제와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium blomide (MTT)는 Sigma(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)는 김해 청원농산에서 제공받았다. L-tyrosine, L-DOPA, 타이로시나아제와 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium blomide (MTT)는 Sigma(St Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- Three independent assays were performed in triplicate and the data shown are the mean ±S.D. *P<0.05 vs. media alone (control); significance of difference between treated groups by ANOVA followed by Dunnett’s test.
이론/모형
- Melanoma cells were treated with 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml of CMWE for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay. Three independent assays were performed in triplicate and the data shown are the mean±SD.
- 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 마우스 B16 melanoma 세포에 대한 독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 열수추출물을 농도별(0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml) 로 처리하여 24시간 후 세포생존율을 측정한 결과, 모든 농도에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다(Fig.
성능/효과
- 37℃에서 15분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. DOPA 산화 억제능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- 본 연구에서도 밀리타리스 동충하초 열수추출물은 농도의존적으로 유의성 있는 타이로시나아제의 활성저해, 최고농도인 5000 µg/ml에서의 약 71% 억제 효능을 나타내었고, 또한 L-DOPA를기질로했을때약 40%의 산화억제능을 나타내는 것으로 보아 멜라닌생성 초기단계의 타이로시나아제의 활성저해 결과로써의 타이로시나아제와 유사한 단백질 역할을 충분히 하고 있는 것으로 생각된다. 또한 최종 멜라닌 생성의 결과에서도 54%의 생성저해를 나타내었으며, 세포독성에서도 최고농도에서 생존율이 50%를 넘었다. 이는 현재 사용중인 미백원료에서의 문제인 세포물질대사의 가역적 저해와 세포독성으로 인한 유전자 변이, 그리고 불안정성 및 피부암 유발 등을 인체에 독성이 없는 천연물질로써 대체 가능한 안전성 확보의 측면에서의 의의가 크다고 하겠다.
- 본 연구에서도 밀리타리스 동충하초 열수추출물은 농도의존적으로 유의성 있는 타이로시나아제의 활성저해, 최고농도인 5000 µg/ml에서의 약 71% 억제 효능을 나타내었고, 또한 L-DOPA를기질로했을때약 40%의 산화억제능을 나타내는 것으로 보아 멜라닌생성 초기단계의 타이로시나아제의 활성저해 결과로써의 타이로시나아제와 유사한 단백질 역할을 충분히 하고 있는 것으로 생각된다.
- 열수추출물을 농도별(0, 313, 625, 1250, 2500, 5000 µg/ml) 로 처리하여 24시간 후 세포생존율을 측정한 결과, 모든 농도에서 50% 이상의 생존율을 나타내었다(Fig. 2).
- 준비된 세포에 열수추출물을 처리하고 7일 후, 흡광도를 이용하여 확인 한 결과 무처리 세포에 비하여 농도의존적으로 유의성 있게 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었으며, 최고농도인 5000 µg/ml 에서는 멜라닌 생성이 54% 억제됨을 확인하였다(Fig. 3).
- 타이로시나아제의 기질을 L-DOPA를 이용하여 밀리타리스 동충하초 열수추출물의 DOPA 산화 억제능을 확인한 결과, L-타이로신을 기질로 사용하였을 때 보다는 낮은 억제율을 나타내었고, 농도의존적으로 유의성 있게 DOPA 산화를 억제하였으며, 최고농도인 5000 µg/ml에서는 약 40% 억제 효능을 나타내었다(Fig. 4B).
- 타이로시나아제의 기질을 L-타이로신을 이용하여 활성을 측정하였을 때, 밀리타리스 동충하초 열수추출물은 농도의존적으로 유의성 있게 타이로시나아제의 활성을 억제하였고, 최고농도인 5000 µg/ml 에서는 약 71% 억제 효능을 나타내었다(Fig. 4A).
후속연구
- 이는 현재 사용중인 미백원료에서의 문제인 세포물질대사의 가역적 저해와 세포독성으로 인한 유전자 변이, 그리고 불안정성 및 피부암 유발 등을 인체에 독성이 없는 천연물질로써 대체 가능한 안전성 확보의 측면에서의 의의가 크다고 하겠다. 이후 흡수율 및 세포투과성 능력까지 고려된다면, 천연물질로써 미백효능이 있는 기능성화장품 원료로 기대된다.
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