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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 돈 태반으로부터 산, 알칼리 및 효소 처리의 방법을 사용하여 유효성분을 추출하고 화장품소재의 안전성시험, 안정성시험 및 효능효과시험(항산화, 미백, 주름개선)을 통하여 돈 태반 추출물의 기능성 화장품소재로서의 응용가능성을 탐색하고자 하였다.
- 보니 차별성이 없어지고 있는 실정이다. 이에 다른 각도에서 기능성 화장품 소재를 개발하고자 돼지 태반에서의 화장품 소재를 검색하고자 하였다.
제안 방법
- 0.2 mM DPPH 에탄올 용액을 제조하여 조제한 액을 여과지 (Whatman No. 2, Germany)에 여과한 후 추출물을 6, 10, 25, 50, 100, 200 gg/ml 사이의 농도로 제조 후 37 ℃에서 30 min간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- MTT(3-(4, 5 -dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다. 96-well plate 에 human fibroblast cell CCD-986sk를 1乂104 cell/ml씩 분주하여 24 시간 배양 후 10, 20, 40, 50, 100 gg/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새 배지로 교체하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 여기에 MTT(5 mg/ml)을 첨가 한 후 37 ℃, 5% CO2 incubator(Sanyo, Japan)에서 배양 2시간 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 570 nm에서 ELISA reader(PowerWave XS2, BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 실시하였다. Elastase 활성억제시험은 다음과 같이 실행하였다 [8]; 0.2 M Tris-Cl bufifer(pH 8.0) 170 μ에 시료 20 μ를 가한 匸다음, 기질 1.0 mM N-succinyl- (Ala)3-p-nitroanilide(Sigma) 50 μ롤 가하였고, 25 ℃에서 10분간 배양한 다음, 2.5 U/ml porcine pancreas elastase(PPE, Sigma)을 20 pl 씩 첨가하였다. 반응혼합물은 다시 25 ℃에서 20분간 배양한 후, 냉침으로 반응을 정지시키고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- [9]. MTT(3-(4, 5 -dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다. 96-well plate 에 human fibroblast cell CCD-986sk를 1乂104 cell/ml씩 분주하여 24 시간 배양 후 10, 20, 40, 50, 100 gg/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새 배지로 교체하고 다시 24시간 동안 배양하였다.
- 사용하였다. Tyrosinase 활성저해시험은 다음과 같이 실시하였다[11]; 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 220 gl, 추출물의 농도를 10, 25, 50, 100, 200 gg/m 로 희석시킨 20 gl과 2,000 U mushroom tyrosinase(5, 370 U/mg, Sigma) 20 gl를 1.5 mM L-Tyrosine 40 gl를혼합한 후 37℃에서 15분간 반응 후 ELISA reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. DOPA 산화활성저해시험은 다음과 같이 시험 되었다; 0.
- 위의 조건에서 화장품의 외관성상의 물리적인 변화, pH 및 점도를 측정하여 안정성을 평가하였다. pH측정은 3 g의 로션제제와 27 g의 D.I water를 섞은 후 실온에서 측정하였고, 점도측정은 Brookfield 점도계 (USA)를 사용하여 돈태반 추출물을 함유한 로션제형에서 Spindle 4, 100 rpm, 30 sec의 조건으로 측정하였다. 안전성시험, 항산화시험, 미백효과시험 및 주름개선효과시험은 3회 반복 실험되었으며, 통계적 유의성에 대한 검증은 Studenfs t-test를 사용하여 95%의 신뢰도 구간으로 계산하였다.
- )를 이용하여 총 단백 함유량을 측정한 결과가 Table 1에 나타나 있다. 돈 태반 추출물은 pH8 의 알칼리처리 (PPH8), pH9 의 알칼리처리 (PPH9), 2시간 효소처리 (PPP2), 16시간 효소처리 (PPP16) 및 산처리 (PPA) 의 5가지 방법으로 얻어졌다. BCA protein assay kit 는 산, 알칼리 및 효소처리 후 잔류한 단백질의 함량을 측정하는 것이므로 그 값이 낮을 수록 아미노산으로 분해가 잘 진행되 었다는 것을 의미한다.
- 돈 태반 추출물의 단백질 함유량은 BCA protein assay kit(Pierce, R℃kford, IL., USA)를 이용하여 즉정하였다. 농도별로 희석한 standard 와 sample을 1.
- 돈 태반 추출물의 안전성을 시험하기 위해 MTT assay를 실시하였으며 그 결과가 Fig. 1에 나타나있다. Fig.
- 돈 태반 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH free radical scavenging assay를 이용하여 측정하였으며 그 결과가 Fig. 2에 나타나 있다. 항산화시험 결과 돈 태반 추출물은 대조군인 비타민 C에 비해서는 모두 낮았으나, 저농도 범위에서 pH9의 알칼리처리한 추출물의 항산화효과가 비교적 우수하였다.
- 돈 태반 추출물이 화장품으로서 첨가물에 들어 갈 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 아마란스화장품에서 제공한 처방전에 따라 로션을 제조하였다. 수상과 유상을 교반한 후 점증제를 넣었으며 돈 태반 추출물은 전체의 1%를 사용하였다.
- 돈 태반으로부터 알칼리 가수분해, 효소처리 및 산처리 가수분해 방법을 이용하여 추출물을 획득하였으며, 본 연구결과 다음의 결론을 얻었다.
- 미백효과시험으로 DOPA 산화활성 저해 시험을 실시하였으며 그 결과가 Fig. 4에 나타나 있다. 대조군은 위의 실험과 동일하게 arbutin, 비타민 C, 비타민 C 유도체를 사용하였다.
- incubator에서 배양하였다. 세포 배양액을 가지고 Pr℃ollagen Type C-peptide EIA kit(Takara, Japan)를 이용하여콜라겐의 양을 측정하였다. 먼저 antibody-POD conjugate solution 100 pl를 각 well 에 첨가하고, sample이나 standard를 20 μl씩 넣은 뒤 shaking 후 37 ℃에서 3시간 반응시킨 후 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400 pl로 4번 세척하였다.
- 아마란스화장품에서 제공한 처방전 (Table 3)에 따라 효소처리한 1% Porcine placenta 추출물을 함유한 로션제제를 제조하였다. 4, 실온, 40의 온도에서 28일간 외관성상, 점도 및 pH의 변화를 측정하였으며 그 결과가 Table 4에 나타나 있다.
- 온도는 4 ℃, 실온, 40 ℃의 3조건을 사용하였고, 측정기간은 28일이었다. 위의 조건에서 화장품의 외관성상의 물리적인 변화, pH 및 점도를 측정하여 안정성을 평가하였다. pH측정은 3 g의 로션제제와 27 g의 D.
- 이후 항온 조에서 37 ℃, 15분간 반응 후 1 ml의 BCA working reagent를 첨가 후 항온조에서 37 ℃, 30분간 반응시 켰다. 그 뒤 실온에서 5~10 분간 방치시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였고, bovMe serum albums standard! 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 돈 태반 추출물의 Hg, Pb, As 등의 중금속 함량은 원자흡수광광도계 (Atomic absorption spectrometer, Simadzu AA-6701) 를 사용하여 (주)한국생명건강에 의해 측정되었다.
- 수상과 유상을 교반한 후 점증제를 넣었으며 돈 태반 추출물은 전체의 1%를 사용하였다. 제조한 로션을 안정성 시험을 거쳐 제형으로 안정한지를 판단하였다. 온도는 4 ℃, 실온, 40 ℃의 3조건을 사용하였고, 측정기간은 28일이었다.
- 주름개선효과 시험법으로는 elastase 활성억제시험 (elastase inhibition assay)과 collagen 생성시험 (collagen synthesis assay)을 실시하였다. Elastase 활성억제시험은 다음과 같이 실행하였다 [8]; 0.
- 반응혼합물은 다시 25 ℃에서 20분간 배양한 후, 냉침으로 반응을 정지시키고 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 25, 50, 100, 200, 400 μgm로 희석시킨 시료용액 20 μ와 2.5 U elastase(porcine pancreas solution) 10 μ를 첨가하여 25 ℃에서 10 min 동안 반응한 후 ELISA reader로 410 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- 콜라겐 생합성 증가를 확인할 수 있는 Pr℃ollagen Type C-peptide EIA kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였으며, 그 결과가 Fig. 6에 나타나 있다. 50 ug/ml의 농도에서 collagen 생합성량은 30% 정도의 증가율을 보여주어서, 20% 정도의 대조군인 비타민 C 보다 높았다.
- Elastase의 활성을 저해시켜 주름 생성을 억제시킴으로써 피부노화를 방지시키는 것이 주름개선소재의 역할이다. 태반 추출물의 피부주름 개선 물질로서의 사용 가능성을 알아보기 위하여 elastase 저해 물질로 알려진 ursolic acid, adenosine을 대조군으로 하여 elastase 저해활성을 측정하였으며, 그 결과 Fig. 5에 나타나 있다. 50 ug/ml 의 농도에서 5가지의 처리법에서 모두 20~30%의 elastase 저해활성을 보여주었으며, 이는 대조군인 ursolic acid 와 adenosine이 모두 10% 내외의 저해율을 보여준 것에 비하면 높은 수준이다.
- 항산화 활성은 DPPH(2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical, Sigma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하였다 [10]. 0.
- 효소처리는 2시간 반응과 16시간 반응의 2가지 방법으로 진행되었다. 2시간 반응법은 태반과 물을 1:2로 한 후 잘게 썬 다음 단백질분해효소 (protease, novozymes, Denmark)를 태반의 1%를 사용하여 2시 간 동안 55 ℃에서 shaking한 후 고속 원심분리기 에서 10, 000 rpm으로 2시간 동안 원심 침전시킨 후 상청액을 수확하였다.
대상 데이터
- 3에 나타나 있다. 대조군으로는 화장품용 미백소재로서 가장 많이 사용되고 있는 arbutin과 비타민 C, 비타민 C 유도체가 사용되었다. 50 μg/ml의 농도에서 pH 8, 9로 알칼리 처리한 경우가 30% 정도의 tyrosinase 억제효과를 보여주었으나, 효소처리 및 산 처리한 경우에는 억제 효과가 10%로 매우 저조하였다.
- 4에 나타나 있다. 대조군은 위의 실험과 동일하게 arbutin, 비타민 C, 비타민 C 유도체를 사용하였다. 50 jug/ml의 농도에서 pH9의 효소처리한 경우가 DOPA-oxidase 억제율이 50%로 가장 높았으며, 나머지의 경우 처리효율은 10~30% 정도를 보여주었다.
- 본 실험에 사용한 돈 태반 (Porcine placenta)은 경남 함양의 지리산 양돈조합에서 수거하여 세척한 후 실험재료로 사용하였다. 돈 태반은 크게 알칼리가수분해, 효소처리 및 산처리의 3가지 방법으로 추출물을 얻었다 [8].
데이터처리
- I water를 섞은 후 실온에서 측정하였고, 점도측정은 Brookfield 점도계 (USA)를 사용하여 돈태반 추출물을 함유한 로션제형에서 Spindle 4, 100 rpm, 30 sec의 조건으로 측정하였다. 안전성시험, 항산화시험, 미백효과시험 및 주름개선효과시험은 3회 반복 실험되었으며, 통계적 유의성에 대한 검증은 Studenfs t-test를 사용하여 95%의 신뢰도 구간으로 계산하였다.
이론/모형
- 그 뒤 실온에서 5~10 분간 방치시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였고, bovMe serum albums standard! 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 돈 태반 추출물의 Hg, Pb, As 등의 중금속 함량은 원자흡수광광도계 (Atomic absorption spectrometer, Simadzu AA-6701) 를 사용하여 (주)한국생명건강에 의해 측정되었다.
- 미백효과시험은 tyrosinase 활성저해시험 (tyrosinase inhibition assay)과 DOPA 산화활성 저해시험 (DOPA oxidation inhibition assay) 을 사용하였다. Tyrosinase 활성저해시험은 다음과 같이 실시하였다[11]; 0.
- 소재의 안전성시험 (stability test)은 MTT assay로 측정되었다 [9]. MTT(3-(4, 5 -dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다.
성능/효과
- (1) 추출물의 단백질함량 측정결과 산처리한 경우가 단백질 함량이 5.5 mg/ml로 가장 낮아서 아미노산으로 분해가 가장 잘 된 것으로 나타났다.
- (2) 돈 태반 추출물의 중금속 함량 시험결과 모두 매우 낮은 수준이어서 화장품소재로서 적절한 것으로 나타났다.
- (3) MTT assay를 사용한 화장품소재 안전성 시험결과 돈 태반 추출물은 모두 50 μg/ml의 돈 태반 추출물농도의 경우 80% 이상의 세포 생존율을 보여주어서 독성이 비교적 낮은 것으로 측정되었다.
- (4) DPPH free radical scavenging assay를 사용한 항산화시험 결과, 50 μg/ml의 농도에서 pH9로 알칼리 처리한 경우가 항산화율이 63%로 가장 높았다. 돈태반 추출물은 전반적으로 대조군인 비타민 C 에 비해서는 모두 낮았다.
- (5) Tyrosinase 활성저해시험과 DOPA 산화활성저해시험을 사용한 미백효과 측정 결과 돈 태반 추출물은 대조군인 arbutin이나 비타민 C 에 비해 그 효과가 다소 낮았다. 그 중 알칼리처리한 추출물의 효과가 50 μg/ml의 농도에서 30% 정도의 tyrosinase 억제효과를 보여주어서 상대적으로 우수하였다.
- (6) Elastase 활성억제시험과 Collagen 생성시험을 이용한 주름 개선 효과 측정결과 돈 태반 추출물은 주름개선 효과가 대조군인 adenosine나 비타민 C 에 비해 우수하였다. 50 μg/ml의 농도에서 5가지의 처리법에서 모두 20~30%의 elastase 저해활성을 보여주어서, 대조군보다 우수하였으며, 특히 효소처리한 추출물의 효과가 가장 우수하였다.
- (7) 돈 태반 추출물 1%를 함유한 로션제제의 화장품을 제조하여 4 ℃, 실온, 40 ℃의 온도 변화에 대해 28일간 외관성상, 점도 및 pH의 변화에 대한 안정성 시험결과 모두 뚜렷한 변화가 관찰되지 않아서 돈 태반 추출물은 화장품제형에서 매우 안정함을 알 수 있었다. 따라서 본 연구결과 돈 태반 추출물은 주름개선 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 높음을 알 수 있었다.
- 4, 실온, 40의 온도에서 28일간 외관성상, 점도 및 pH의 변화를 측정하였으며 그 결과가 Table 4에 나타나 있다. 28일간의 실험결과 온도 및 시간의 변화에 따른 외관성상, 점도 및 pH의 뚜렷한 변화가 관찰되지 않아서 돈 태반 추출물은 화장품제형에서 매우 안정함을 알 수 있었다.
- 5에 나타나 있다. 50 ug/ml 의 농도에서 5가지의 처리법에서 모두 20~30%의 elastase 저해활성을 보여주었으며, 이는 대조군인 ursolic acid 와 adenosine이 모두 10% 내외의 저해율을 보여준 것에 비하면 높은 수준이다. 측정범위의 농도영역에서 elastase 활성저해는 대조군에 비해 매우 우수하였으며 특히 효소처리한 추출물 (PPP2, PPP16) 의 효과가 가장 높았다.
- 6에 나타나 있다. 50 ug/ml의 농도에서 collagen 생합성량은 30% 정도의 증가율을 보여주어서, 20% 정도의 대조군인 비타민 C 보다 높았다. 콜라겐의 생합성 증가는 저농도에서는 알칼리 처리한 추출물 (PPH8, PPH9)의 효과가 높았으며, 고농도에서는 효소 처리한 추출물 (PPP2, PPP16)의 효과가 우수하였다.
- 비타민 C 에 비해 우수하였다. 50 μg/ml의 농도에서 5가지의 처리법에서 모두 20~30%의 elastase 저해활성을 보여주어서, 대조군보다 우수하였으며, 특히 효소처리한 추출물의 효과가 가장 우수하였다.
- 1의 X축은 돈 태반 추출물의 농도를 나타내며 Y축은 세포 생존율을 의미한다. Human CCD-986sk 세포에 대한 돈 태반추출물의 세포 독성을 측정한 결과, 5가지의 추출법 모두에서 50 pg/ml의 돈 태반 추출물농도의 경우 80%이상의 세포생존율을 보여주어서 돈 태반 추출물의 세포 독성은 매우 낮은 것으로 나타났다.
- 에 비해 그 효과가 다소 낮았다. 그 중 알칼리처리한 추출물의 효과가 50 μg/ml의 농도에서 30% 정도의 tyrosinase 억제효과를 보여주어서 상대적으로 우수하였다.
- 돈 태반 추출물의 항산화효과와 미백효과는 대조군에 비해 다소 약했지만, 주름개선 효과는 대조군에 비해 매우 우수하였다. 그리고 돈 태반 추출물 1%가 함유된 로션 제형의 안정성 시험에서도 우수한 결과를 보여주었다. 따라서 돈 태반 추출물은 주름 개선 기능성화장품소재로서 가능성이 높음을 알 수 있었다.
- 또한 적었다. 돈 태반 추출물의 항산화효과와 미백효과는 대조군에 비해 다소 약했지만, 주름개선 효과는 대조군에 비해 매우 우수하였다. 그리고 돈 태반 추출물 1%가 함유된 로션 제형의 안정성 시험에서도 우수한 결과를 보여주었다.
- 그리고 돈 태반 추출물 1%가 함유된 로션 제형의 안정성 시험에서도 우수한 결과를 보여주었다. 따라서 돈 태반 추출물은 주름 개선 기능성화장품소재로서 가능성이 높음을 알 수 있었다.
- 있었다. 따라서 본 연구결과 돈 태반 추출물은 주름개선 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 높음을 알 수 있었다.
- 전체적으로 DOPA 산화활성저해효과는 역시 대조군에 비해 낮았으며, 그 중에서도 고 농도 범위에서 알칼리 처리한 추출물 (PPH8, PPH9)의 효과가 비교적 높았다. 미백효과 시험 결과를 종합하면 돈 태반 추출물은 대조군에 비해 그 효과가 다소 낮았으나, 그 중에서도 알칼리처리한 추출물의 효과가 비교적 우수하였다.
- 본 연구의 결과 돈 태반 추출물은 중금속 함량이 매우 낮았으며, 세포독성 또한 적었다. 돈 태반 추출물의 항산화효과와 미백효과는 대조군에 비해 다소 약했지만, 주름개선 효과는 대조군에 비해 매우 우수하였다.
- BCA protein assay kit 는 산, 알칼리 및 효소처리 후 잔류한 단백질의 함량을 측정하는 것이므로 그 값이 낮을 수록 아미노산으로 분해가 잘 진행되 었다는 것을 의미한다. 실험결과 산처리가 5.5 mg/ml로 가장 단백질의 함량이 낮았고, 알칼리처리가 그 다음이었으며, 효소처리의 경우 단백질 함량이 상대적으로 높았다.
- 50 μg/ml의 농도에서 pH 8, 9로 알칼리 처리한 경우가 30% 정도의 tyrosinase 억제효과를 보여주었으나, 효소처리 및 산 처리한 경우에는 억제 효과가 10%로 매우 저조하였다. 전반적으로 tyrosinase 저해효과는 대조군에 비해 다소 낮았으나, 알칼리처리한 추출물 (PPH8, PPH9) 에서 비교적 우수하게 나타났다.
- 50 jug/ml의 농도에서 pH9의 효소처리한 경우가 DOPA-oxidase 억제율이 50%로 가장 높았으며, 나머지의 경우 처리효율은 10~30% 정도를 보여주었다. 전체적으로 DOPA 산화활성저해효과는 역시 대조군에 비해 낮았으며, 그 중에서도 고 농도 범위에서 알칼리 처리한 추출물 (PPH8, PPH9)의 효과가 비교적 높았다. 미백효과 시험 결과를 종합하면 돈 태반 추출물은 대조군에 비해 그 효과가 다소 낮았으나, 그 중에서도 알칼리처리한 추출물의 효과가 비교적 우수하였다.
- 콜라겐의 생합성 증가는 저농도에서는 알칼리 처리한 추출물 (PPH8, PPH9)의 효과가 높았으며, 고농도에서는 효소 처리한 추출물 (PPP2, PPP16)의 효과가 우수하였다. 주름개선 효과를 정리하면 돈 태반 추출물은 주름개선 효과가 대조군에 비해 우수하였고 그 중에서도 효소처리한 추출물 (PPP2, PPP16)의 효과가 매우 우수하였다.
- 50 ug/ml 의 농도에서 5가지의 처리법에서 모두 20~30%의 elastase 저해활성을 보여주었으며, 이는 대조군인 ursolic acid 와 adenosine이 모두 10% 내외의 저해율을 보여준 것에 비하면 높은 수준이다. 측정범위의 농도영역에서 elastase 활성저해는 대조군에 비해 매우 우수하였으며 특히 효소처리한 추출물 (PPP2, PPP16) 의 효과가 가장 높았다.
- 50 ug/ml의 농도에서 collagen 생합성량은 30% 정도의 증가율을 보여주어서, 20% 정도의 대조군인 비타민 C 보다 높았다. 콜라겐의 생합성 증가는 저농도에서는 알칼리 처리한 추출물 (PPH8, PPH9)의 효과가 높았으며, 고농도에서는 효소 처리한 추출물 (PPP2, PPP16)의 효과가 우수하였다. 주름개선 효과를 정리하면 돈 태반 추출물은 주름개선 효과가 대조군에 비해 우수하였고 그 중에서도 효소처리한 추출물 (PPP2, PPP16)의 효과가 매우 우수하였다.
- 2에 나타나 있다. 항산화시험 결과 돈 태반 추출물은 대조군인 비타민 C에 비해서는 모두 낮았으나, 저농도 범위에서 pH9의 알칼리처리한 추출물의 항산화효과가 비교적 우수하였다. 50 pg/ml 의 돈 태반 추출물농도에서 pH9로 알칼리 처리한 경우가 항산화율이 63%로 가장 높았고 나머지의 처리법에서는 45% 내외의 항산화율을 보여주었으며, 비타민 C 에 비해서는 그 효과가 저조하였다.
- 화장품 중금속 검사에서 중요한 수은, 납 및 비소가 모두 매우 낮아서 본 연구에서 사용한 돈 태반은 화장품소재로서 적절함을 알 수 있었다.
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