[논문]인간 배아 줄기세포와 암 세포에서의 C6orf62의 발현 패턴

유한나; 류중기; 최성준; 김진경

[국내논문] 인간 배아 줄기세포와 암 세포에서의 C6orf62의 발현 패턴
Expression of C6orf62 in Human Embryonic Stem Cells and Cancer Cells 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.34 no.3, 2010년, pp.229 - 233

유한나 (차의과학대학교 의생명과학대학원 유전자조절실험실) , 류중기 (차의과학대학교 의생명과학대학원 유전자조절실험실) , 최성준 (차의과학대학교 의생명과학대학원 유전자조절실험실) , 김진경

Abstract ▼ AI-Helper

Pluripotency and self-renewal capacity of human embryonic stem cells (hESCs) are retained by hESCs related genes as OCT4, SOX2 and NANOG. These genes are shown high expression level in diverse cancer cells and have potential role in the carcinogenesis. On the contrary to this, several genes which are up-regulated in the differentiated hESCs are involved to suppress the carcinogenesis or proliferation of cells. We discovered several genes in immortalized lung fibroblast (WI-38 VA13) by suppression subtractive hybridization. Among them, we focused chromosome 6 open reading frame 62 (C6orf62) which is uncharacterized, mapped to 6p22.3 and generated to Hepatitis B virus X-transactivated proteins (HBVx-transactivated proteins, XTP). Aim of this study was to characterize C6orf62 through analyzing of expression pattern in various cell lines. Expression of C6orf62 was significantly upregulated in diverse normal cell lines than cancer cell lines. And C6orf62 was up-regulated in differentiated hESCs (endothelial cells, neural cells) compared to those of undifferentiated hESCs. Also, C6orf62 in WI-38 cells was highly up-regulated during G1/S transition of the cell cycle. Taken together, C6orf62 is shown expression pattern similar to differentiated hESCs-associated genes which down-regulated in cancer cells. Therefore, we assume that C6orf62 may participate to suppress the proliferation and to induce differentiation through regulating the cell cycle.

Keyword

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

그 중 특징과 기능이 크게 밝혀지지 않은 유전자 chromosome 6 open reading frame 62(C₆orf62)에 초점을 맞추어 어떠한 유전자적 특징을 가지는지 연구하였다.C₆orf62 는 chromosome 6의 6p22.
81688). 본 연구에서, 우리는 C₆orf62의 발현 패턴을 통해 그 특징을 밝히고, 나아가 배아 줄기세포의 분화와 폐암어i 관련된 유전자로서 의 중요성과 기능을 예상하고자 한다.
본 연구팀은 유전자 C₆orf62의 발현 정도를 여러 세포주와 조직에서 비교하기 위해 역전사 중합효소 연쇄 반응을 시행하였다. C₆orf62는 배아 줄기세포(CHA3hESCs)에서보다 분화된 형태인 내피세포와 신경세포에서 높은 발현 수준을 보였다(Fig.

제안 방법

그 밖에 실험에 사용된 여러 세포 주는 American Type Culture CollectionfManassas, VA) 과 한국세포은행(Seoul, Korea)으로부터 확립하였다. 각각의 세포 주에 적합한 배양액에 10% FBS, 10) ng/ml의 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가하였으며, 모든 세포 주는 5.0%C₆와 37℃ 의 환경하에 배양되었다.
Tissue Bank로부터 제 공받았다. 한 환자로부터 정 상조직과 암 조직을 함께 채취한 한 쌍의 형태로 이루어져 있으며, 폐 선암 조직 11쌍과 폐 편평세포암 조직 10쌍으로 실험을 진행하였다. 모든 조직 샘플을 TRI-REAGENT®(Mole- cular Research Center; Cincinnati, Ohio, USA) 에 담은 채로 균질화 하였고 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
RNA를 분리하였다. ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies, Inc.) 를 이용하여 Azeo와 Azso/Aaso 비율을 즉 청하였고 1.2% 아가로즈 젤에 전기 영동하여 RNA의 상태를 판단하였다. 남아 있는 genomic DNA의 오염을 방지하기 위해 DNase I(Roche, Germany)을 37℃ 에서 20분간 처리하였다.
2% 아가로즈 젤에 전기 영동하여 RNA의 상태를 판단하였다. 남아 있는 genomic DNA의 오염을 방지하기 위해 DNase I(Roche, Germany)을 37℃ 에서 20분간 처리하였다.
중합효소 연쇄 반응은 다음의 조건으로 수행하였다. cDNA의 변성을 위해 94℃에서 5분, 그 후 94 ℃ 에서 30초, 각 primer의 annealing 온도에서 (Table 1) 30 초, 72℃에서 30초 처리주기를35회 반복하였고, 마지막 신장단계를 위해 72℃에서 5분간 처리하였다. PCR 산물을 확인하기 위해 1% 아가로즈 젤에 전기 영 동 하였고, PCRe 3번 반복 수행하였다.
cDNA의 변성을 위해 94℃에서 5분, 그 후 94 ℃ 에서 30초, 각 primer의 annealing 온도에서 (Table 1) 30 초, 72℃에서 30초 처리주기를35회 반복하였고, 마지막 신장단계를 위해 72℃에서 5분간 처리하였다. PCR 산물을 확인하기 위해 1% 아가로즈 젤에 전기 영 동 하였고, PCRe 3번 반복 수행하였다.
WI38의 serum stimulation으로 얻은 세포들로 SYBR Gr- eenl kit (Qiagen; Hilden, Germany)을 이용하여 qRT- PCR 을 수행하였다. CFX96™ Real time System (Bio-Rad, PMadelpHa, USA)을 사용하였으며, 결과는 comparative threshold (Ct) 법을 이용하여 분석하였다.
C₆orf62가 세포주기와 관련되어 있는지 알아보기 위해 정상 폐 유래 섬유아 세포주 WI-38의 동기화(synchronizing) 를 유도했다(Fig. 4). 각 시간별 세포들의 cyclin D 발현 수준으로 보아 G1/S 변환기는 약 4시간 후에 나타난 것으로 보인다.
여러 세포주와 폐 조직으로부터 im-REAGENT® 를 이용하여 RNA를 분리하였다. ND-1000 분광광도계(NanoDrop Technologies, Inc.

대상 데이터

인간 배아 줄기세포(CHAShESCs), 내피세포(endothelial cells, ECs), 신경세포(Neural cells, NCs)는 CHA Stem CeU ]뜨stitute로부터 제공받았다. 그 밖에 실험에 사용된 여러 세포 주는 American Type Culture CollectionfManassas, VA) 과 한국세포은행(Seoul, Korea)으로부터 확립하였다.
제공받았다. 그 밖에 실험에 사용된 여러 세포 주는 American Type Culture CollectionfManassas, VA) 과 한국세포은행(Seoul, Korea)으로부터 확립하였다. 각각의 세포 주에 적합한 배양액에 10% FBS, 10) ng/ml의 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가하였으며, 모든 세포 주는 5.
폐 선암(AC) 조직과 폐 편평세포암(SCC) 조직은 Korea Limg Tissue Bank로부터 제 공받았다. 한 환자로부터 정 상조직과 암 조직을 함께 채취한 한 쌍의 형태로 이루어져 있으며, 폐 선암 조직 11쌍과 폐 편평세포암 조직 10쌍으로 실험을 진행하였다.
cDNA는 1 Ji g의 RNA로부터 SuperScript™ First-Strand Synthesis SystemQnvitrogen; Carlsbad, CA, USA) 을 이용하여 역 전사 하였고, 합성 된 cDNA의 양을 표준화 하기 위해 18SrRNA를 사용하였다. 중합효소 연쇄 반응은 다음의 조건으로 수행하였다.
정상 폐 유래 섬유아 세포주인 WL38을 10개의 100 mm 배양접시에 각각 lxi06 세포 수를 seeding 하였다. 10 % FBS가 포함된 배양액으로 70% 정도의 밀도에 이를 때까지 배양하였다.

이론/모형

수행하였다. CFX96™ Real time System (Bio-Rad, PMadelpHa, USA)을 사용하였으며, 결과는 comparative threshold (Ct) 법을 이용하여 분석하였다. 우선 C₆orf62의발현 수준을 18S로 표준화하고 (AC(=Ct C₆OT/62 - Ct 18s rRNA), 기준으로 삼은 0시간째 세포에서의 발현 수준을 1로 놓았을 때, 그와 비교하여 다른 시 간에서 얻은 세포의 발현 수준을 비율로 나타내었다 (△△Ct=△Ct _c6orfi2 (나머지 시간 각각의 세포) — △Gt_C6orf62 _{(0시간째 세포)}, 2^(-△△Ct).

성능/효과

CFX96™ Real time System (Bio-Rad, PMadelpHa, USA)을 사용하였으며, 결과는 comparative threshold (Ct) 법을 이용하여 분석하였다. 우선 C₆orf62의발현 수준을 18S로 표준화하고 (AC(=Ct C₆OT/62 - Ct 18s rRNA), 기준으로 삼은 0시간째 세포에서의 발현 수준을 1로 놓았을 때, 그와 비교하여 다른 시 간에서 얻은 세포의 발현 수준을 비율로 나타내었다 (△△Ct=△Ct _c6orfi2 (나머지 시간 각각의 세포) — △Gt_C6orf62 _{(0시간째 세포)}, 2^(-△△Ct).
1). 또한, 각각의 정상 세포 주에서 그들의 암 세포 주와 비 교하였을 때 C₆orf62의 발현 정도가 높은 수준을 보임을 관찰하였으며, 몇 가지 암 세포 주에서 발현이 낮게 일어남을 관찰하였다(Fig. 2A). 특히 정상 폐 유래 섬유아세포 주에서 여러 폐암 세포주보다(폐 선암, 폐 편평세포암, 폐선 편평세포암) 훨씬 강하게 발현되고 있음을 관찰하였다 (Fig.
2A). 특히 정상 폐 유래 섬유아세포 주에서 여러 폐암 세포주보다(폐 선암, 폐 편평세포암, 폐선 편평세포암) 훨씬 강하게 발현되고 있음을 관찰하였다 (Fig. 2AZ B). 이러한 발현 양상이 조직에서도 동일하게 일어나는지 를 비교하기 위해 조직 에서 발현 차이를 보았으며, 11 쌍의 폐 선암 조직 중 8쌍이(72.
2AZ B). 이러한 발현 양상이 조직에서도 동일하게 일어나는지 를 비교하기 위해 조직 에서 발현 차이를 보았으며, 11 쌍의 폐 선암 조직 중 8쌍이(72.7%), 10쌍의 폐 편평세포암 조직 중 6쌍이 (60%) 세포 주에서 와 마찬가지로 정 상 조직 에서암 조직보다 높은 C₆orf62의 발현량을 보였다(Fig. 3).
있다. 여러 정상 세포주에서 암세포주보다높은 발현 수준을 보였고, 이러한 발현 현상은 특히 폐암세포와 조직에서 두드러지 게 나타났다(Fig. 1, 2). 특정한 분화 세포에 특이적 이진 않았지 만 분화하면서 발현이 증가하는 양상 또한 보였다.
결론적으로, C₆orf62는 배아 줄기 세포의 분화에 관련되 어있고, 정상세포에서 암 억제 유전자와 같은잠재적 기능을 가지고 있을 것으로 예상되며, 이러한 기능은 세포주기의 G1/S 변환기를 조절하는 능력과도 연관되어 있을 것으로 사료된다. 또한 C₆orf62를 계속적으로 연구 한다면 줄기세포 분화나 폐암 형성의 분자적인 메커니즘을 이해하는 데에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.

후속연구

이들 중에서 종종 암세포의 발생과 성장을 저해하는 암 억제자(tumor suppressor)와 같은 기능을 가지는 유전자가 보고되고 있다(Ma 등, 2008). 따라서 배아 줄기세포의 자가재생 능력 유지와 분화, 암 형성의 촉진과 억제는 상호연관성이 있는 것으로 생각되며, 이와 관련된 유전자를 찾는 것은 이러한 현상들의 분자적 메커니즘을 밝히는데 도움이 될 것으로 사료된다.
또한 C₆orf62를 계속적으로 연구 한다면 줄기세포 분화나 폐암 형성의 분자적인 메커니즘을 이해하는 데에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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