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문제 정의
- 본 연구는 식용식물로의 가치뿐만 아니라 약용으로 가치가 인정되는 뽕잎에 미생물 생균제를 이용한 뽕잎발효차 개발을 통하여 기능성 소재 개발 및 새로운 제품 개발의 방안을 제시하고자 뽕잎차 및 뽕잎발효차 추출물의 S-180 고형암, 항알레르기 활성을 비교분석 하였다. in vivo 상에서 S-180 고형암 억제 효과는 뽕잎차에서 16.
- 또한 Shim 등(18)은 뽕잎의 탁월한 약리 효과에서 염증세포로부터 발생되는 활성산소종 및 환경호르몬이 유도한 염증성 신호전달을 억제하는 염증질환 치료제로서의 가능성을 제시하였다. 이에 본 연구는 식용식물로의 가치뿐만 아니라 약용으로 가치가 인정되는 뽕잎차와 뽕잎에 미생물 생균제를 이용한 뽕잎발효차의 S-180 고형암의 항암성 및 항알레르기 활성을 비교 분석한 결과를 바탕으로 기능성 소재 및 새로운 제품 개발의 방안을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 그리고 뽕잎발효차는 생 뽕잎을 세척, 음건한 다음 5분간 찌는 과정을 거친 후, 찐 뽕잎에 발효용 종균(MGW-1, 대구한의대 모가웰)을 접종하여 37℃에서 2일간 발효하였다. 2회에 걸쳐 건조, 비빔 증제과정을 거친 후 90℃에서 3분간 볶는 과정 거친 뒤, 80℃에서 30분 건조한 후 포장하여 시제품을 제작하였다. 완성된 시제품은 냉장보관하면서 분석 시료로 사용하였다(Fig.
- HMC-1의 염증성 cytokine 측정 결과: 염증반응을 일으키는데 있어 중요한 역할을 하는 cytokine들 중 활성화된 비만세포에서 분비되는 cytokine은 TNF-α, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-13 등이 있으며, 만성적인 알레르기성 염증을 보이는 천식이나 아토피환자에서 TNF-α, IL-4, IL-6, IL-8의 농도가 높다고 알려져 있어(29) 본 연구에서는 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α, IL-6, IL-8의 양을 측정하였다.
- Histamine 측정: 배양한 HMC-1을 모아 PBS로 세척하고 PBS에 현탁하여 세포수를 측정하였다. 3×106 cells의 세포를 tyrode buffer에 현탁하여 37℃에서 5분간 배양한 다음 sample을 넣고 30분 배양한 뒤 compound 48/80을 처리하여 20분 배양하고 4℃에서 5분간 반응을 종결시켜 원심분리 하여 상등액을 수거하였다.
- S-180 고형암 성장억제 실험은 Jo(19)의 방법을 변형하여 실시하였다. ICR 마우스는 항온항습시스템에서 1주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다.
- 각 시료 20 g에 대하여 증류수를 2 L 가하고 약탕기(NPM-1302, (주)엔유씨전자, 대구, Korea)로 1시간 30분, 2회 반복 추출하여 30 mL/kg/day(0.15°Brix) 급식하였다.
- 그 다음에 biotin이 부착된 2차 항체(1 μg/mL) 100 μL/well을 일정 시간 상온에서 반응시킨 후, avidin-peroxidase(2.5 μg/mL) 100 μL/well을 첨가하였다.
- 1). 그리고 뽕잎발효차는 생 뽕잎을 세척, 음건한 다음 5분간 찌는 과정을 거친 후, 찐 뽕잎에 발효용 종균(MGW-1, 대구한의대 모가웰)을 접종하여 37℃에서 2일간 발효하였다. 2회에 걸쳐 건조, 비빔 증제과정을 거친 후 90℃에서 3분간 볶는 과정 거친 뒤, 80℃에서 30분 건조한 후 포장하여 시제품을 제작하였다.
- 뽕잎차는 생 뽕잎을 수돗물에 세척한 것을 음건한 다음, 5분간 찌는 과정을 거친 후, 2회에 걸쳐 건조, 비빔 증제하였다. 그리고 90℃에서 3분간 볶은 후 80℃에서 30분간 건조하여 포장하였다(Fig.
- 뽕잎차와 뽕잎발효차 열수 추출물의 항암효과를 검증하기 위하여 ICR 생쥐의 고형암 억제 효과를 조사하였다(Table 1). S-180 세포를 ICR 생쥐의 우측 서혜부에 피하접종한지 28일이 지난 후 마우스로부터 적출한 대조군의 고형암괴 무게는 1.
- 15°Brix) 급식하였다. 종양세포 이식 29일째 되는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고, 그 무게를 측정한 후, 종양 성장 저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.R.: %)을 계산하였다.
- 즉 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4×107 cells/mL가 되게 하였다.
대상 데이터
- S-180 고형암 성장억제 실험은 Jo(19)의 방법을 변형하여 실시하였다. ICR 마우스는 항온항습시스템에서 1주간 적응하여 S-180 세포를 7주령 된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 즉 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 채취하고 RPMI 1640 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4×107 cells/mL가 되게 하였다.
- 본 연구의 재료는 영천지역 농가에서 재배한 청일 뽕잎(mulberry leaves)을 2008년 6월 중순에 채취하여 뽕잎차 및 뽕잎발효차의 시제품을 제조하는데 사용하였다.
- 세포배양: 실험에 사용한 HMC-1(human mast cell)은 37℃ 습윤한 5% CO2 incubator에서 Iscove's Modified Dulbecco's Medium에 10% FBS를 첨가하여 배양하였다.
- 알레르기는 제 1형 과민반응이 가장 대표적이고 IgE 항체와 비만세포에 의해서 일어나는데(27) 본 연구에서는 비만세포의 탈 과립을 유도하는 인자 중에서 compound 48/80을 사용하였다. Compound 48/80은 formaldehyde에 의하여 cross linked 된 phenethylamine의 mixed polymer로 비만세포 수용체에 작용하여 세포외 칼슘을 세포내로 유입시켜서 증가된 자유칼슘이 비만세포의 탈과립 및 히스타민 유리를 강력하게 일으키며, 세포내 cAMP-phosphodiesterase의 파괴를 억제하여 cAMP 양을 감소시키는 것으로 알려져 있다(28).
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 12.0 for windows program(SPSS, Chicago, USA)을 이용(22)하여 통계처리 하여 실험군당 평균±표준편차로 나타내었으며, 각 군의 평균차에 대한 통계적 유의성 검정은 Duncan의 다중검증법(DMRT:Duncan's multiple range test)으로 분석하였다(p<0.05).
이론/모형
- 따라서 사람 비만 세포주 HMC-1에 시료를 농도별로 처리하여 배양한 후 비만 세포를 활성화시키는 PMA 및 calcium ionophore A23187을 처리한 다음, 3시간 배양 후 상등액을 수거하여 상등액에 포함된 IL-6, IL-8, TNF-α의 양을 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용하여 측정하였다.
- 배양 후 비만 세포를 활성화시키는 PMA(phorbol-12-myristate 13-acetate, Sigma Co., 25 μg/mL), PMACI(calcium ionophore A23187, 1 μM)을 20시간 동안 처리한 다음 상등액을 수거하여 상등액에 포함된 IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF의 양을 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용하여 측정하였다(21).
- 상등액 속에 포함된 histamine의 양은 Shore 등(20)의 방법에 따라 시행하였다. 즉, 상등액 500 μL에 0.
성능/효과
- 본 연구는 식용식물로의 가치뿐만 아니라 약용으로 가치가 인정되는 뽕잎에 미생물 생균제를 이용한 뽕잎발효차 개발을 통하여 기능성 소재 개발 및 새로운 제품 개발의 방안을 제시하고자 뽕잎차 및 뽕잎발효차 추출물의 S-180 고형암, 항알레르기 활성을 비교분석 하였다. in vivo 상에서 S-180 고형암 억제 효과는 뽕잎차에서 16.67%, 뽕잎발효차에서 17.78%로 나타났다. 뽕잎차 및 뽕잎발효차 추출물의 항알레르기 효과를 검증한 결과 두 군 모두 에탄올 추출물보다 열수 추출물이 히스타민 분비 억제에 더 효과적이었고, HMC-1의 염증성 cytokine을 측정한 결과 추출물 군에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 염증성 cytokine의 억제율이 더 높았고 뽕잎발효차군이 뽕잎차군에 비해 더 효과적이었다.
- 따라서 사람 비만 세포주 HMC-1에 시료를 농도별로 처리하여 배양한 후 비만 세포를 활성화시키는 PMA 및 calcium ionophore A23187을 처리한 다음, 3시간 배양 후 상등액을 수거하여 상등액에 포함된 IL-6, IL-8, TNF-α의 양을 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용하여 측정하였다. 그 결과 IL-6은 뽕잎차 및 뽕잎발효차 열수 추출물에서 각각 21.97%, 5.49% 억제되었고, 뽕잎차 및 뽕잎발효차의 에탄올 추출물에서는 각각 16.48%, 21.97% 억제됨을 알 수 있었다(Table 3). 뽕잎차 열수 추출물과 뽕잎발효 에탄올 추출물이 IL-6의 억제율이 21% 이상인 것으로 나타나 비슷한 경향으로 분석되었으며, 뽕잎발효차의 열수 추출물을 처리한 군에서 가장 낮은 억제율을 보였다.
- 그리고 뽕잎차 및 뽕잎발효차 에탄올 추출물에서의 히스타민 분비 억제효과는 나타나지 않았다. 따라서 뽕잎차 및 뽕잎발효차 두 군 모두 에탄올 추출물보다 열수 추출물이 히스타민 분비 억제 효과가 더 높은 것을 알 수 있었다.
- 무처리 대조군(0.81±0.06 ng/mL)에 비해 히스타민 분비를 유도하는 compound 48/80을 처리하였을 때 히스타민의 분비량(5.39±0.03 ng/mL)이 증가하였으며, 뽕잎차 및 뽕잎발효차의 열수 추출물에서 일부 히스타민 분비량이 억제되는 것으로 나타났다(Table 2).
- 뽕잎차 및 뽕잎발효차 열수 추출물 군 모두 TNF-α을 억제시키지 못하거나 미미하였으나, 뽕잎차 및 뽕잎발효차의 에탄올 추출물 군에서는 각각 29.70%, 47.85%로 나타나서 TNF-α의 억제율이 높은 것으로 조사되었다.
- 뽕잎차 및 뽕잎발효차 열수 추출물을 각각 100 μg/mL로 처리하였을 때 뽕잎차 열수 추출물의 히스타민 분비 억제율이 21% 더 높은 결과를 얻었다.
- 78%로 나타났다. 뽕잎차 및 뽕잎발효차 추출물의 항알레르기 효과를 검증한 결과 두 군 모두 에탄올 추출물보다 열수 추출물이 히스타민 분비 억제에 더 효과적이었고, HMC-1의 염증성 cytokine을 측정한 결과 추출물 군에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 염증성 cytokine의 억제율이 더 높았고 뽕잎발효차군이 뽕잎차군에 비해 더 효과적이었다. 뽕잎발효차 추출물의 기능성이 더 우수한 것은 발효를 통해 생리활성 물질이 생성된 것이 원인으로 사료되며 이 점에 있어 구체적인 연구가 필요하다고 판단된다.
- 97% 억제됨을 알 수 있었다(Table 3). 뽕잎차 열수 추출물과 뽕잎발효 에탄올 추출물이 IL-6의 억제율이 21% 이상인 것으로 나타나 비슷한 경향으로 분석되었으며, 뽕잎발효차의 열수 추출물을 처리한 군에서 가장 낮은 억제율을 보였다. 뽕잎차에서 열수 추출물을 처리한 것이 에탄올을 처리한 것에서보다 IL-6의 억제율이 조금 더 높은 경향을 보였으며, 뽕잎발효차에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물을 처리한 것에서보다 IL-6의 억제율이 16.
- 78% 감소하였다. 뽕잎차군과 뽕잎발효차군의 고형암괴 억제율 차이는 미미한 것으로 나타났다.
- 50 g이었다. 뽕잎차군의 고형암괴 무게가 대조군에 비하여 16.67% 억제율을 보이는 것으로 분석되었다. 그리고 뽕잎발효차군의 고형암괴의 무게는 1.
- 뽕잎차 열수 추출물과 뽕잎발효 에탄올 추출물이 IL-6의 억제율이 21% 이상인 것으로 나타나 비슷한 경향으로 분석되었으며, 뽕잎발효차의 열수 추출물을 처리한 군에서 가장 낮은 억제율을 보였다. 뽕잎차에서 열수 추출물을 처리한 것이 에탄올을 처리한 것에서보다 IL-6의 억제율이 조금 더 높은 경향을 보였으며, 뽕잎발효차에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물을 처리한 것에서보다 IL-6의 억제율이 16.48% 더 높은 것으로 조사되었다. 뽕잎차 및 뽕잎발효차 열수 추출물 군 모두 TNF-α을 억제시키지 못하거나 미미하였으나, 뽕잎차 및 뽕잎발효차의 에탄올 추출물 군에서는 각각 29.
- 85%로 나타나서 TNF-α의 억제율이 높은 것으로 조사되었다. 에탄올 추출물에서 뽕잎발효차 군이 뽕잎차 군보다 18.15% 더 높은 결과를 얻었다. 본 실험 결과 뽕잎의 열수 및 에탄올 추출물이 일부 염증성 cytokine을 억제하는 것으로 나타나 앞으로 알레르기성 질환의 예방 및 억제를 위한 제품개발의 소재로 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 즉 뽕잎차의 열수 추출물 군에서는 1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때 농도와 비례하여 히스타민 분비량이 8.95%, 12.23%, 42.14%로 억제되었음을 알 수 있었다.
후속연구
- 15% 더 높은 결과를 얻었다. 본 실험 결과 뽕잎의 열수 및 에탄올 추출물이 일부 염증성 cytokine을 억제하는 것으로 나타나 앞으로 알레르기성 질환의 예방 및 억제를 위한 제품개발의 소재로 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 뽕잎차 및 뽕잎발효차 추출물의 항알레르기 효과를 검증한 결과 두 군 모두 에탄올 추출물보다 열수 추출물이 히스타민 분비 억제에 더 효과적이었고, HMC-1의 염증성 cytokine을 측정한 결과 추출물 군에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 염증성 cytokine의 억제율이 더 높았고 뽕잎발효차군이 뽕잎차군에 비해 더 효과적이었다. 뽕잎발효차 추출물의 기능성이 더 우수한 것은 발효를 통해 생리활성 물질이 생성된 것이 원인으로 사료되며 이 점에 있어 구체적인 연구가 필요하다고 판단된다.
- 또한 Bae 등(24)의 감초 표고버섯균사체 추출물의 항암효과에 관한 연구에서 고형암괴 무게가 대조군에 비하여 감초추출물을 공급한 군에서 37% 억제되었고, 감초균사체 발효추출물을 공급한 군에서 56% 억제되었다는 결과를 보고한 바 있다. 이러한 결과와 비교해 볼 때 뽕잎차와 뽕잎발효차의 열수 추출물에 대한 고형암괴의 증식 억제율은 크지 않은 것으로 분석되었으나, 항암활성의 가능성이 있어 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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