A simple, rapid method for determining amoxicillin (AMO) and ampicillin (AMP) in aquatic products (flatfish, salmon, shrimp, tilapia, and yellow croaker) was evaluated. For quantification, the AMO and AMP ions at m/z 348.9 and 105.9, respectively, were selected. The limit of detection (LOD) and limi...
A simple, rapid method for determining amoxicillin (AMO) and ampicillin (AMP) in aquatic products (flatfish, salmon, shrimp, tilapia, and yellow croaker) was evaluated. For quantification, the AMO and AMP ions at m/z 348.9 and 105.9, respectively, were selected. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for detecting AMO were 0.09 and $0.25\;{\mu}g/L$, respectively. The respective values for AMP were 0.02 and $0.05\;{\mu}g/L$. After $100\;{\mu}g/L$ AMO treatment, the level decreased 10% after 7 days at $5^{\circ}C$, while it decreased 20% at $25^{\circ}C$. After 7 days, 94.9.100% of $100\;{\mu}g/L$ AMP remained after storage at $5^{\circ}C$, while 62.3.100% remained after storage at $25^{\circ}C$. Using the food code method, the recovery of AMO ranged from 64.1.92.0% and that of AMP from 44.8.86.2%. With a protein centrifugation method, the recovery of AMO ranged from 39.8.87.9% and that of AMP from 78.0.98.1%. With liquid-liquid extraction, the recovery of AMO ranged from 36.5.88.3% and that of AMP from 31.8.75.1%.
A simple, rapid method for determining amoxicillin (AMO) and ampicillin (AMP) in aquatic products (flatfish, salmon, shrimp, tilapia, and yellow croaker) was evaluated. For quantification, the AMO and AMP ions at m/z 348.9 and 105.9, respectively, were selected. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for detecting AMO were 0.09 and $0.25\;{\mu}g/L$, respectively. The respective values for AMP were 0.02 and $0.05\;{\mu}g/L$. After $100\;{\mu}g/L$ AMO treatment, the level decreased 10% after 7 days at $5^{\circ}C$, while it decreased 20% at $25^{\circ}C$. After 7 days, 94.9.100% of $100\;{\mu}g/L$ AMP remained after storage at $5^{\circ}C$, while 62.3.100% remained after storage at $25^{\circ}C$. Using the food code method, the recovery of AMO ranged from 64.1.92.0% and that of AMP from 44.8.86.2%. With a protein centrifugation method, the recovery of AMO ranged from 39.8.87.9% and that of AMP from 78.0.98.1%. With liquid-liquid extraction, the recovery of AMO ranged from 36.5.88.3% and that of AMP from 31.8.75.1%.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 식품공전에 소개된 AMO 및 AMP 분석방법의 유효성을 확인하고 유도체과정이 없는 몇몇의 분석방법들을 수산물에 적용하여 회수율을 살펴보고 간편․신속한 AMO 및 AMP 분석방법을 검토하고자 하였다.
제안 방법
AMO 및 AMP의 안정성은 표준원액을 10, 100, 1000 μg/L 농도로 탈이온수로 희석하여 각각 만든 후, 5℃와 25℃에서 보관하면서 UPLC-MS/MS를 이용하여 안정성을 살펴보았다.
HPLC-PDA 분석을 위한 표준곡선은 AMO 및 AMP 표준원액을 0.2, 0.5, 1.0, 5.0 mg/L의 농도로 탈이온수로 희석하였다. 유도체를 위해 희석한 각 표준용액 1 mL에 탈이온수 4 mL, 20% TCA 0.
Ternandez-Torres et al. (2010)에서 소개한 방법을 변형하여 시료 1 g을 원심분리관에 넣고 0.2 M citrate solution 4 mL과 methanol 4 mL을 가하여 균질화하고 초음파로 5분간 처리한 다음, 6,600×g에서 5분간 원심분리를 하여 상층액은 새 원심분리관에 담았다.
UPLC-MS/MS 분석을 위한 표준곡선은 AMO 및 AMP 표준원액을 10, 20, 50, 100, 200 μg/L의 농도로 탈이온수로 희석하여 유도체과정 없이 UPLC-MS/MS로 분석한 다음 농도에 따른 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성하였다.
UPLC-MS/MS의 검출한계 (LOD, limit of detection)는 MassLynx software에서 신호대 잡음비 (S/N, signal to noise ratio)가 >3으로 하였으며, 정량한계 (LOQ, limit of quantitation)는 >10으로 하였다.
조제된 시료는 원심분리관에 넣어 -20℃에서 보관하였고 실험 당일에 상온에서 녹인 후, AMO 및 AMP 혼합용액을 각 농도별로 시료에 spiking하여 분석용 시료로 사용하였다. 수산물 종류에 따른 분석방법별로 5회 반복실험을 실시하였다.
4%의 회수율을 보고하였다. 식품공전에서 수산물에 대한 AMO 및 AMP의 분석방법은 물로 추출한 후 TCA 및 diethyl ether를 사용하여 단백질 및 지질을 제거하고 유도체과정을 거친 후 diehyl ether로 추출하여 UV검출기로 측정하였다. 이 방법은 AMO에서 양호한 회수율을 보이지만 diethyl ether의 사용으로 분석자의 건강에 악영향을 주고 추출물의 농축, 유도체과정 등으로 전처리시간이 다소 긴 단점을 가지고 있었다.
05 mg/kg 으로 설정되었다. 식품공전에서는 AMO 및 AMP를 유도체과정을 거쳐서 분석하고 있지만 본 연구에서는 유도체과정이 없는 몇몇의 분석방법들을 수산물에 적용하여 검토하였다 (Fig. 6). 식품공전 분석방법은 AMO에서 양호한 회수율을 보였지만 diethyl ether의 사용, 추출물의 농축, 유도체과정 등으로 전처리시간이 다소 긴 단점을 가지고 있었다.
9로 나타났다. 어미이온 (precursor ion)으로부터 NH3가 떨어진 m/z 348.9이 이온세기가 가장 크고 안정하기 때문에 AMO의 정량이온 (quantification ion)으로 선택하였다. AMP의 딸이온은 m/z 191.
원심분리가 끝난 상층액을 0.2 μm syringe filter로 여과하여 UPLC-MS/MS로 분석하여 표준용액과 비교한 후 회수율을 산출하였다.
원심분리를 실시한 액을 0.2 μm syringe filter로 여과하여 UPLC-MS/MS로 분석하여 표준용액과 비교한 후 회수율을 산출하였다.
이 과정을 반복하여 diethyl ether 추출액 12 mL을 50℃에서 농축한 후 탈이온수 1 mL을 가하여 용해한 다음 0.2 μm syringe filter로 여과하여 HPLC-PDA로 분석하여 표준용액과 비교한 후 회수율을 산출하였다.
이 과정을 반복하여 diethyl ether 추출액 12 mL을 50℃에서 농축한 후 탈이온수 1 mL을 가하여 용해한 다음 0.2 μm syringe filter로 여과하여 HPLC-PDA로 분석한 다음 농도에 따른 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성하였다.
대상 데이터
Anhydrous의 AMO 및 AMP를 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며 각각의 구조식 및 분자량은 Fig. 1에 나타내었다. 표준품 10 mg을 정량하여 탈이온수 100 mL로 정용하고 초음파로 녹여 표준원액을 조제하여 -20℃에 보관하면서 사용하였다.
HPLC-PDA는 Agilent 1100 series (Palo Alto, CA, USA)를 사용하였으며 분석조건은 Table 1에 나타내었다. UPLC-MS/MS는 ACQUITY Ultra Performance LCTM system (Waters, Milford, MA, USA) 및 Micromass Quattro Premier XE API triple quadrupole mass spectrometer (Waters, Micromass, Manchester, UK)를 사용하였으며 분석조건은 Table 2에 나타내었다.
실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 급을 사용하였다. 본 실험에서는 넙치 (Paralichthys olivaceus), 홍다리얼룩새우 (Penaeus semisulcatus), 대서양연어 (Salmo salar), 틸라피아 (Sarotherodon niloticus), 부세 (Larimichthys crocea)의 근육부위만 취하여 homogenizer (HMF-985, Hanil, Korea)로 균질화하였다. 조제된 시료는 원심분리관에 넣어 -20℃에서 보관하였고 실험 당일에 상온에서 녹인 후, AMO 및 AMP 혼합용액을 각 농도별로 시료에 spiking하여 분석용 시료로 사용하였다.
실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 급을 사용하였다.
이론/모형
KFIA (2010)에서 소개된 AMO 및 AMP의 분석방법으로 전처리를 실시하였다. 시료 5 g을 원심분리관에 넣고 탈이온수 40 mL을 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 6,600×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하였다.
UPLC-MS/MS에 의한 AMO 및 AMP의 검출한계와 정량한계를 Table 3에 나타내었다. 크로마토그램 결과를 smoothing method (2:1)를 적용하여 peak-to-peak 방식으로 계산하여 S/N를 구하였다. AMO의 검출한계와 정량한계는 각각 0.
성능/효과
4에 나타내었다. AMO 및 AMP의 표준용액의 각 농도를 각각 HPLC-PAD와 UPLC-MS/MS로 측정한 후 1차 회귀식으로부터 얻은 R2값은 양쪽 모두 0.9994-0.9999의 높은 직선성을 보여주었다. UPLC-MS/MS에 의한 AMO 및 AMP의 검출한계와 정량한계를 Table 3에 나타내었다.
AMO의 검출한계와 정량한계는 각각 0.09, 0.25μg/L로 나타났으며 AMP는 0.02, 0.05 μg/L으로 만족할 만한 수준을 보여 주었다.
1% (새우)으로 나타났다. Liquid-liquid extraction 분석방법에서 수산물의 종류에 따라 회수율 차이는 있었지만 평균적으로 AMO는 61.0%, AMP는 56.9%의 회수율이 나타났다. De Baere et al.
1% (새우류)으로 나타났다. Protein centrifugal devices 분석방법에서 수산물의 종류에 따라 회수율 차이는 있었지만 평균적으로 AMO는 61.1%, AMP는 86.8%의 회수율이 나타났다. Wang (2004)은 AMO 및 AMP는 양쪽성 화합물로서 추출과정에서의 손실, matrix에 의한 이온화과정 영향 등으로 회수율이 낮게 나타나는 것으로 보고하였다.
식품공전 분석방법은 AMO에서 양호한 회수율을 보였지만 diethyl ether의 사용, 추출물의 농축, 유도체과정 등으로 전처리시간이 다소 긴 단점을 가지고 있었다. Protein centrifugal devices 분석방법은 AMP에서 양호한 회수율을 보였지만 추출과정에서의 손실, matrix에 의한 이온화과정 영향 등으로 AMO의 회수율이 수산물 종류에 따라서 다르게 나타났다. Liquid-liquid extraction 분석방법은 간단한 전처리가 가능하지만 AMO 및 AMP 회수율이 낮게 나타났다.
3에 나타내었다. 다른 수산물에서도 MS/MS 크로마토그램은 비슷하게 나타났으며 표준물질과 수산물의 방해물질의 retention time이 분리되어 있어서 양호한 크로마토그램을 얻을 수 있었다. Reyns et al.
2% (넙치)으로 나타났다. 식품공전 분석방법에서 수산물의 종류에 따라 회수율 차이는 있었지만 평균적으로 AMO는 83.0%, AMP는 61.7%의 회수율이 나타났으며 AMO가 AMP보다 회수율이 높게 나타났다. Jo et al.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
항생물질이란?
항생물질은 미생물, 생합성, 반합성 등에 의하여 생산되는 화학물질로서, 저농도에서 다른 미생물의 증식을 억제하거나 죽이는 능력을 가진 화학물질로 정의된다. 지금까지 발견된 항생물질은 1만종 이상이며 생성하는 생물체, 저해되는 생물체, 화학구조 등에 의하여 분류된다.
동물용의약품 중 항생제의 과용과 오남용으로 인한 결과는?
주로 사용되는 동물용의약품은 tetracycline계열이 약 700톤 정도로 가장 높은 비율을 차지하고 있으며, penicillin계열이 170톤, sulfa계열이 160톤 등이 사용되는 것으로 보고되었다 (KFDA, 2006). 이러한 항생제는 적절하게도 사용되기도 하지만 안전사용 기준을 따르지 않고 무분별하게 과용, 오∙남용되어 사용된 항생제가 동물과 그 가공품에 잔류하여 내성균의 출현을 비롯하여 균교대증과 allergy 증상 등을 초래하게 되었다 (Choi and Lee, 2009). 항생물질의 내성문제는 사람의 건강 및 생명과 직결되는 문제로서 항생물질의 적절한 사용, 안전관리 등의 중요성이 대두되고 있다 (Oh et al., 2009).
Penicillin계열 항생제의 세균에 대한 살균 기작은?
오늘날에는 페니실린 내성 등으로 여러 가지 문제점이 있지만 아직까지 전 세계적으로 널리 사용되고 있다 (Shitandi and Sternesjo, 2004). Penicillin계열 항생제의 세균에 대한 살균기작은 세균의 세포벽 물질인 peptidoglycan의 합성을 촉매하는 transpeptidase와 D-alanine carboxypeptidase에 작용하여 peptidoglycan의 합성을 저해함으로서 세균의 성장을 억제하거나 사멸시키는 것으로 알려져 있다 (Lee, 2001). 주로 사용되는 penicillin계열 항생제는 amoxicillin (AMO), ampicillin (AMP), dicolxacillin, penicillin G, penicillin V 등이며 우리나라에서 2007년도에 어류와 갑각류의 AMO 및 AMP 최대잔류허용기준 (maximum residue level)을 각각 0.
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