살모넬라는 음식과 식수에서 흔히 나오는 중요한 병원체로 세계 곳곳에서 급성 위장염과 같은 감염증을 일으키며, 일반적으로 인간의 혈청형 임상종으로는 Salmonella enterica의 혈청형인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis가 있다. 일반적인 검출 방법으로 살모넬라를 기본으로 하여 선택적인 배양으로 샘플을 수집하였고 살모넬라를 일으키는 군체의 특징을 생화학과 혈청학상인 테스트를 하였으나 이러한 방법들은 일반적으로 시간이 걸리고 높은 감도를 보이지 않았다. 최근, 등온증폭반응법과 real-time PCR법을 이용하여 높은 감도, 특이성으로 현재 병원성 박테리아에 빠르게 수행할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 등온증폭반응과 real-time PCR법을 사용하여 S. Typhimurium과 S. Enteritidis의 검출하였다. 선택적인 타겟 유전자로, invA를 살모넬라종의 염기서열에 특이적으로 임의복제 하였다. 등온증폭반응과 real-time PCR은 살모넬라종으로부터 임의의 염기서열을 증폭하여 검출하였고, invA는 S. Typhimurium과 S. Enteritidis의 두 가지 종을 모두 검출하였다. 이러한 등온증폭반응과 real-time PCR법으로 S.Typhimurium과 S. Enteritidis의 검출 가능성을 보였으며, 살모넬라 종에 대한 특이성, 민감성을 갖춘 유용한 검출방법을 제시하였다.
살모넬라는 음식과 식수에서 흔히 나오는 중요한 병원체로 세계 곳곳에서 급성 위장염과 같은 감염증을 일으키며, 일반적으로 인간의 혈청형 임상종으로는 Salmonella enterica의 혈청형인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis가 있다. 일반적인 검출 방법으로 살모넬라를 기본으로 하여 선택적인 배양으로 샘플을 수집하였고 살모넬라를 일으키는 군체의 특징을 생화학과 혈청학상인 테스트를 하였으나 이러한 방법들은 일반적으로 시간이 걸리고 높은 감도를 보이지 않았다. 최근, 등온증폭반응법과 real-time PCR법을 이용하여 높은 감도, 특이성으로 현재 병원성 박테리아에 빠르게 수행할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 등온증폭반응과 real-time PCR법을 사용하여 S. Typhimurium과 S. Enteritidis의 검출하였다. 선택적인 타겟 유전자로, invA를 살모넬라종의 염기서열에 특이적으로 임의복제 하였다. 등온증폭반응과 real-time PCR은 살모넬라종으로부터 임의의 염기서열을 증폭하여 검출하였고, invA는 S. Typhimurium과 S. Enteritidis의 두 가지 종을 모두 검출하였다. 이러한 등온증폭반응과 real-time PCR법으로 S.Typhimurium과 S. Enteritidis의 검출 가능성을 보였으며, 살모넬라 종에 대한 특이성, 민감성을 갖춘 유용한 검출방법을 제시하였다.
Salmonella is an important food-and water-borne pathogen associated with acute gastrointestinal illnesses around the world. The most common serotypes isolated from humans are Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and S. Enteritidis. Traditional detection methods for Salmonella ar...
Salmonella is an important food-and water-borne pathogen associated with acute gastrointestinal illnesses around the world. The most common serotypes isolated from humans are Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and S. Enteritidis. Traditional detection methods for Salmonella are based on cultures using selective media and characterization of suspicious colonies by biochemical and serological tests. These methods are generally time-consuming and not so highly sensitive. Recently, the Loop Mediated Isothermal Amplification and real-time PCR has been used as a highly sensitive, specific, and rapid test for the presence of pathogenic bacteria. In this study, a LAMP and real-time PCR was used to detect S. Typhimurium and S. Enteritidis. We selected target genes, which were the in invA and a randomly cloned sequence specific for the genus Salmonella. With LAMP and real-time PCR, random sequence was detected from Salmonella spp, invA were detected from all strain of S. Typhimurium and S. Enteritidis. This assay indicate that the specificity, sensitivity and rapid of the LAMP and real-time PCR make them potentially valuable tools for detection of S. Typhimurium and S. Enteritidis.
Salmonella is an important food-and water-borne pathogen associated with acute gastrointestinal illnesses around the world. The most common serotypes isolated from humans are Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and S. Enteritidis. Traditional detection methods for Salmonella are based on cultures using selective media and characterization of suspicious colonies by biochemical and serological tests. These methods are generally time-consuming and not so highly sensitive. Recently, the Loop Mediated Isothermal Amplification and real-time PCR has been used as a highly sensitive, specific, and rapid test for the presence of pathogenic bacteria. In this study, a LAMP and real-time PCR was used to detect S. Typhimurium and S. Enteritidis. We selected target genes, which were the in invA and a randomly cloned sequence specific for the genus Salmonella. With LAMP and real-time PCR, random sequence was detected from Salmonella spp, invA were detected from all strain of S. Typhimurium and S. Enteritidis. This assay indicate that the specificity, sensitivity and rapid of the LAMP and real-time PCR make them potentially valuable tools for detection of S. Typhimurium and S. Enteritidis.
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문제 정의
또한 식중독균 진단이 필요한 임상 및 기타 장소에서 진단 시스템으로 사용 할 수 있을 것이며, 진단시간의 단축으로 병원성 미생물 및 유행성 미생물의 조기 검출에 새로운 방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
1.5% (w/v) agarose gel을 이용하여 Mupid-α (Advance, Japan) 전기 영동장치로 PCR 산물을 분석하였다.
DNA polymerase와는 달리 5'→3' exonuclease의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 접합 및 신장이 수행되어 진다. 21-22 따라서 본 연구에서는 그러므로 기존의 검출 방법보다 감도 있고 빠른 현장 적용성이 가능하고, 살모넬라균의 상피세포에 대한 부착과 침습에 관련된 invA 유전자를 낮은 검출률, 긴 소요시간, 오염에 노출, 그리고 작업의 불편함 등의 문제점을 보완한 등온 증폭법과 실시간으로 모니터링이 가능한 real-time PCR법으로 살모넬라균 검출 방법을 연구하였다.
DNA 추출 후 PCR primer set(Table 1) 및 LAMP primer set(Table 4)을 이용하여 유전자를 증폭시킨 후 정제를 거쳐 DNA 염기서열분석법(ABI 3730xl DNA analyser)을 통하여 식중독균의 S. Typhimurium과 S. Enteritidis DNA를 최종 확인하였다.
DNA 추출 후 PCR primer set(Table 1)을 이용하여 유전자를 증폭시킨 후 정제를 거쳐 DNA 염기서열분석법(ABI 3730xl DNA analyer)을 통하여 살모넬라균종 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 최종 확인하였다.
DNA의 증폭은 Chromo4TM System(Bio-Rad, USA), GeneAmpⓇ PCR System 2700(Applied Biosystems, USA)을 사용 하였고, 중합효소 연쇄반응 산물 확인은 Mupid-α (Advance, Japan) 전기영동장치를 이용하였다.
Phenol 추출법을 이용하여 살모넬라 균주에서 S. Typhimurium과 S. Enteritidis의 genomic DNA를 추출(Fig. 1)하였으며 추출결과는 등온증폭반응이나 real-time PCR 반응을 통해 확인하였다.
정제된 증폭산물이 살모넬라균 DNA가 맞는지 최종적으로 확인하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다. 그 후 동일한 primer에 등온 증폭법에 사용할 추가 primer를 첨가하여 살모넬라균종인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 일반 PCR법과 등온 증폭 법을 적용하여 실험하였다.
그 후에 gel을 떼어내어 EtBr(ethidium bromide)로 10 분간 염색하고 다시 10분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 EtBr을 씻어냈다. 마지막으로 UV transilluminator 위에 agarose gel을 올려놓고 PCR 여부를 확인하였다.
살모넬라감염증의 역학적 연구는 serotype, 생물형, 약 제내성형, phage type의 조사 등으로 이루어지고 있으나 이들을 파악하는 것만으로는 미흡한 실정이므로 최근에는 plasmid profile, 중합효소 연쇄반응(PCR), southern blothybridization 기법을 기초로 한 분자유전학적 분석이 이루어지고 있다. 사람의 주요 식중독균으로 알려진 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 신속하고 특이적으로 검출하기 위하여 Salmonella specific primer를 제작하여 식중독균 내 invA 유전자를 증폭하는 real-time PCR법과 등온증폭반응법을 실시하였다.21-22
살모넬라균에서 추출한 S. Typhimurium과 S. Enteritidis 의 genomic DNA를 real-time PCR을 이용해 검출하였고 master mix 속에 들어있는 SYBR Green I이 DNA 이중나선 사이로 결합되어 나타나는 형광을 측정함으로써 Ct와 Tm을알 수 있고 이를 통해 시료의 농도, 증폭여부 및 종을 확인할 수 있다. Ct 값은 증폭물이 나타나면서 형광이 증가하기 시작하는 점으로 주형의 농도가 많을수록 빠른 시간 내에 나타난다.
살모넬라균에서의 DNA 추출에는 PrimePrepTM Genomic DNA Isolation Kit(Genet Bio, Korea)을 사용하였고, 전기영동의 agarose는 QA-AgaroseTM(Q-bio gene, USA)을 이용 하였다.
살모넬라균종 S. Typhimurium과 S. Enteritidis DNA 원액(1.4 × 107 copy/mL)을 단계 희석하여 1.4 × 107~ 1.4 × 100 copy/mL의 농도에서 검출 테스트를 통해 등온증폭법과 real-time PCR를 비교하였다(Table 7).
살모넬라균종인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis에서 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 invA 유전자 부위를 증폭을 시킨 후 증폭된 DNA를 전기영동법에 의해 확인하였고, 이를 정제하였다. 정제된 증폭산물이 살모넬라균 DNA가 맞는지 최종적으로 확인하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다.
임상시료에서 추출한 살모넬라균 genomic DNA와 등온 증폭반응용 premix와 혼합하여 등온 증폭하였고 전기영동을 통해 S. Typhimurium과 S. Enteritidis을 검출하였고 일반 PCR을 통해 등온증폭반응의 특이성과 민감도를 확인하였다(Table 6, Fig. 4, 5).
Enteritidis에서 genomic DNA를 추출하여 PCR을 이용하여 invA 유전자 부위를 증폭을 시킨 후 증폭된 DNA를 전기영동법에 의해 확인하였고, 이를 정제하였다. 정제된 증폭산물이 살모넬라균 DNA가 맞는지 최종적으로 확인하기 위해서 DNA 염기서열분석법을 시행하였다. 그 후 동일한 primer에 등온 증폭법에 사용할 추가 primer를 첨가하여 살모넬라균종인 S.
총 20 µL의 PCR 반응용액(Table 3)은 master mix 10 µL, primer(F,R) 각각 0.5 µL, D.W 8 µL 와 DNA 1 µL로 구성되었으며 master mix는 한번에 100 µL 를 제조하여 0.2 mL PCR 반응 튜브에 분주한 후, real-time PCR법을 이용해서 DNA를 증폭시켰다.
총 20 µL의 등온증폭 반응용액(Table 5)은 premix 18.5 µL와 DNA 1.5 µL로 구성되었으며 premix는 한번에 제조하여 0.2 mL PCR 반응 튜브에 18.5 µL씩 동량 분주한 후, DNA를 첨가하여 등온증폭법을 이용해서 DNA를 증폭시켰다.
대상 데이터
본 연구에서는 생물자원센터(BRC)와 한국미생물보존 센터(KCCM)에서 분양받은 살모넬라균종인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis를 이용하여 실험하였다.
성능/효과
4 × 102 copy/mL의 범위내에서 검출되어 등온증폭법이 일반 PCR의 경우보다 더 높은 검출 한계를 가지고 있고 real-time PCR의 경우 비슷한 검출 능력을 보였다. 두 번째로 검출 시간 테스트 결과에서는 일반 PCR법은 변성, 접합, 신장의 온도변화를 두고 90분의 시간이 소요되었고, realtime PCR의 경우 2시간 30분의 시간이 소요되었다. 이에 반해 등온증폭법은 PCR법에서의 변성, 접합, 신장의 온도변화를 두지 않고 한 온도에서 세 단계를 모두 시행함에 따라서 실험소요시간을 단축할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
이에 반해 등온증폭반응법은 1.4 × 107~1.4 × 102 copy/mL의 범위내에서 검출되어 등온증폭법이 일반 PCR의 경우보다 더 높은 검출 한계를 가지고 있고 real-time PCR의 경우 비슷한 검출 능력을 보였다.
일반 PCR법, real-time PCR법 그리고 등온증폭법으로 식중독균내의 invA 유전자를 증폭한 결과 real-time PCR의경우 실시간 모니터링이 가능하여 정량정성 분석이 가능 하나 분석시간이 긴 반면 등온증폭법의 경우 단시간에 식중독균의 감염 여부를 할 수 있었다.
첫 번째로 검출 능력 테스트 결과에서 일반 PCR법으로 식중독균내 invA 유전자를 증폭한 결과 1.4 × 107 ~ 1.4 × 106 copy/mL의 범위내에서 검출이 가능하였고 Real-time PCR 의 경우 invA 유전자를 1.4 × 107 ~ 1.4 × 103 copy/mL의 범위내에서 검출되었다.
혈청형에 따른 감염양상을 살펴보면 1996년 이전까지의 Salmonella Typhimurium과 Salmonella Enteritidis의 분리 율이 가장 높은 것으로 나타났다. 살모넬라속 균의 DNA 검사에는 plasmid profile, 중합효소연쇄반응(PCR), southern blot hybridization을 기초로 한 분자유전학적 분석 및 제한 효소 처리에 의한 DNA의 절단 양상 등을 분석하여 역학관계를 규명하고 있다.
후속연구
본 연구에서는 앞으로 등온증폭법의 검출 한계를 넓혀서 현 결과보다 더 낮은 copy수의 주형 DNA에서도 검출 가능한 조건을 확립할 계획이다. 또한 식중독균 이외에도 브루셀라, 바실러스 시리우스, 스타필로 코커스 등 다양한 병원성 미생물에 적용할 계획이며 이외에 현재 심각한 유행성 감염균으로 떠오르고 있는 신종플루에도 적용 가능할 것으로 보인다.
본 연구에서는 앞으로 등온증폭법의 검출 한계를 넓혀서 현 결과보다 더 낮은 copy수의 주형 DNA에서도 검출 가능한 조건을 확립할 계획이다. 또한 식중독균 이외에도 브루셀라, 바실러스 시리우스, 스타필로 코커스 등 다양한 병원성 미생물에 적용할 계획이며 이외에 현재 심각한 유행성 감염균으로 떠오르고 있는 신종플루에도 적용 가능할 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
살모넬라란 무엇인가?
살모넬라는 음식과 식수에서 흔히 나오는 중요한 병원체로 세계 곳곳에서 급성 위장염과 같은 감염증을 일으키며, 일반적으로 인간의 혈청형 임상종으로는 Salmonella enterica의 혈청형인 S. Typhimurium과 S. Enteritidis가 있다. 일반적인 검출 방법으로 살모넬라를 기본으로 하여 선택적인 배양으로 샘플을 수집하였고 살모넬라를 일으키는 군체의 특징을 생화학과 혈청학상인 테스트를 하였으나 이러한 방법들은 일반적으로 시간이 걸리고 높은 감도를 보이지 않았다.
살모넬라증에 감염시 나타날 수 있는 위장증상에는 무엇이 있는가?
파라티푸스는 장티푸스의 증상과 비슷하나 장티푸스보다 심하지 않은 임상증상을 보인다. 살모넬라증은 12 ~ 36시간의 잠복기간을 거쳐 발열, 두통, 복통, 설사, 구역, 구토 등의 위장증상이 나타난다. 탈수가 일어나고, 유아나 고령자는 중증이 될 수 있으며, 급성증상은 1 ~ 2일 만에 사라지나 식욕부진과 설사는 7일간 계속되기도 한다.
병원성 박테리아를 검출하는 일반적인 검출 방법이 가진 느린 속도의 한계를 극복한 최근의 검출 기법에는 무엇이 있는가?
일반적인 검출 방법으로 살모넬라를 기본으로 하여 선택적인 배양으로 샘플을 수집하였고 살모넬라를 일으키는 군체의 특징을 생화학과 혈청학상인 테스트를 하였으나 이러한 방법들은 일반적으로 시간이 걸리고 높은 감도를 보이지 않았다. 최근, 등온증폭반응법과 real-time PCR법을 이용하여 높은 감도, 특이성으로 현재 병원성 박테리아에 빠르게 수행할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 등온증폭반응과 real-time PCR법을 사용하여 S.
참고문헌 (22)
Nam, H.-M.; Srinivasan, V.; Gillespie, B. E.; Murinda, S. E.; Oliver, S. P. Int. J. Food Microbiol. 2005, 102, 161.
Daum, L. T.; Barnes, W. J.; McAvin, J. C.; Neidert, M. S.; Cooper, L. A.; Huff, W. B.; Gaul, L.; Riggins, W. S.; Morris, S. Salem; A. Lohman, K. L. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 3050.
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