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문제 정의
- 본 연구는 사매추출물의 기능성 화장품 원료 및 화장품 개발의 이용 가능성과 관련하여 주름개선에 대한 효능 및 효과를 평가하였고, DWFC에 대한 인체적용시험을 세명대학교 한방바이오 임상지원센터와 공동으로 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 본 연구에서는 에탄올 농도별 사매추출물의 항산화, 콜라게네이즈 억제 활성 여부를 관찰하였으며, 이중 항산화 활성 및 콜라게네이즈 억제활성이 우수한 30% 에탄올 추출물이 1 % 함유되어 있는 Di-Wrinkle Free Cream을 제조하여 인체적용시험을 통해서 주름 개선 효능을 확인하고자 하였다.
- 따라서 피부 주름 개선에 있어 reactive oxygen species(ROS)와 같은 활성산소를 제거하는 항산화 물질이나 콜라게네이즈의 작용을 억제하고 콜라겐의 합성을 촉진시키는 소재의 발굴이 중요하다. 현재 주름 개선에 이용되고 있는 비타민 A, 비타민 C와 비타민 A, C 유도체 등 다양한 항산화제가 있지만, 피부에 대한 안전성 문제점이 있어 부작용이 적은 천연물에서 주름 개선에 효과가 있는 소재를 개발하고자 한다.
제안 방법
- 따라서 실제적으로 사람의 피부 주름 개선에 영향을 주는지 확인하기 위하여 사매추출물을 1 % 함유한 DWFC에 대하여 인체 적용 시험을 실시하였다. PRIMOS를 이용하여 피부 주름 측정 및 3D 이미지 분석을 이용하여 DWFC의 주름 개선 효과를 측정하였다. PRIMOS를 이용한 주름 parameter인 R3z 값 전체를 paired t-test를 통해 DWFC 제품 전후간의 유의성 여부를 가설 평균 차 5 % (* p < 0.
- Shaker에서 15 min 간 용해시키고, ELISA reader를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하여 사매 추출물의 NIH-3T3 cell에 대한 세포 독성을 측정하였다.
- 검량곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성 비교 표준액으로 Trolox (water soluble analogue of vitamin E, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethlychrman-2-carboxylic acid, Aldrich Chem, Inc. Milw. WI)를 인산 완충용액을 가하여 각각 0.0, 1.65, 3.125, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 µM 농도로 희석하여 표준 곡선을 작성하였다.
- 피험자 방문 시 마다 이상반응(홍반, erythema), 부종(edema), 인설(scaling), 가려움(itching), 자통(stinging), 작열감(burning), 뻣뻣함(tightness), 따끔거림(pricking)이나 다른 이상반응이 발생하는지 육안평가와 문진으로 평가하였으며, 자극 증세 혹은 증상이 없었는지, 약한 정도인지, 중간 정도인지, 심한 정도인지를 구분하여 기록하였다. 그리고 시험 중지 또는 탈락사항이 발생하는지 점검하여 case report form에 기입하였다. 방문하는 날이 아니더라도 시험에 더 이상 참가 할 수 없게 되는 경우는 본인의 서명이 첨부된 ‘시험참가 포기동의서’를 쓰도록 하였다.
- In vitro 실험에서 사매추출물의 항산화 및 콜라게네이즈를 억제시키는 효과를 확인하였으며, 이는 간접적으로 콜라겐 생성 촉진 효과가 있는 것으로 판단된다. 따라서 실제적으로 사람의 피부 주름 개선에 영향을 주는지 확인하기 위하여 사매추출물을 1 % 함유한 DWFC에 대하여 인체 적용 시험을 실시하였다. PRIMOS를 이용하여 피부 주름 측정 및 3D 이미지 분석을 이용하여 DWFC의 주름 개선 효과를 측정하였다.
- 따라서, 다양한 항산화 활성 측정방법 중 ORAC assay를 사용하였으며, phosphate buffer와 시료를 fluorescent solution에 mix후, radical generator인 AAPH를 첨가하여 산화반응 유발 후 fluorescence의 증가 또는 감소에 대한 kinetic 반응을 확인하였다. 본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성 phosphate buffer를 사용하였다.
- 사매 20 g를 에탄올 농도별(0, 30, 50, 70, 100%) 200 mL로 70 ℃에서 18 h 동안 추출하여 Filter paper No. 2로 여과한 다음 여액은 rotary evaporator (N-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 40 ± 5 ℃ 범위 내에서 감압 농축 및 동결건조 후 갈색의 powder를 얻어 -80 ℃에 보관, 본 실험의 재료로 사용하였다.
- 섬유아세포에서 사매추출물의 처리가 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포 생존율을 측정하였다(Figure 1). 피부를 구성하는 주 단백질인 콜라겐은 피부진피에 존재하는 섬유아세포에서 합성이 되는데, 30 % 에탄올 사매추출물은 피부 섬유아세포에 대한 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
- 피험자의 눈가 주름 정도를 PRIMOS를 이용하여 평가하였다. 제품 도포 전(0주), 제품 도포 후 4주, 제품 도포 후 8주 경과 후에 임상센터에 방문한 피험자들을 대상으로 눈가의 주름 정도를 PRIMOS 전용 software를 사용하여 평가하였다. 측정 부위의 동일성을 유지하기 위하여 이미지 overlay 기능을 사용하였다.
- 제품 도포 전(0주), 제품 도포 후 4주, 제품 도포 후 8주에 한방바이오산업임상지원 센터에 방문하여 측정 및 평가를 실시하였다. 피시험자 평가는 공기의 이동이 없고 직사광선이 없으며 항온 항습 조건(22 ± 2 ℃, 40 ~ 60 %)을 만족하고 있는 밀폐된 방에서 최소 30 min 간 피부 안정을 취한 다음 시험하였다.
- 주름 생성 부위를 디지털 카메라(Nikon D200 digital camera, Japan)로 사진을 촬영하였으며, 방문 시 마다 동일한 품질의 사진을 얻기 위하여 촬영 조건을 고정하고 촬영하였다.
- 피시험자 평가는 공기의 이동이 없고 직사광선이 없으며 항온 항습 조건(22 ± 2 ℃, 40 ~ 60 %)을 만족하고 있는 밀폐된 방에서 최소 30 min 간 피부 안정을 취한 다음 시험하였다. 주름 측정 부위는 눈꼬리 부위에서 평가하였다.
- 제품 도포 전(0주), 제품 도포 후 4주, 제품 도포 후 8주 경과 후에 임상센터에 방문한 피험자들을 대상으로 눈가의 주름 정도를 PRIMOS 전용 software를 사용하여 평가하였다. 측정 부위의 동일성을 유지하기 위하여 이미지 overlay 기능을 사용하였다. PRIMOS는 인공 광원에서 방출된 빛이 피부에 투영될 때 생기는 fringe friction을 이용하여 피부 주름 개선 정도를 평가하는 기기이다[30].
- 피시험자 평가는 공기의 이동이 없고 직사광선이 없으며 항온 항습 조건(22 ± 2 ℃, 40 ~ 60 %)을 만족하고 있는 밀폐된 방에서 최소 30 min 간 피부 안정을 취한 다음 시험하였다.
- 시험 도중 다음과 같은 이상반응 및 그 밖의 이유로 탈락한 피험자는 없었으며 최종 피험자 수는 21명이었다. 피험자 방문 시 마다 이상반응(홍반, erythema), 부종(edema), 인설(scaling), 가려움(itching), 자통(stinging), 작열감(burning), 뻣뻣함(tightness), 따끔거림(pricking)이나 다른 이상반응이 발생하는지 육안평가와 문진으로 평가하였으며, 자극 증세 혹은 증상이 없었는지, 약한 정도인지, 중간 정도인지, 심한 정도인지를 구분하여 기록하였다. 그리고 시험 중지 또는 탈락사항이 발생하는지 점검하여 case report form에 기입하였다.
- 항산화 및 콜라게네이즈 활성이 우수한 30 % 에탄올사매추출물을 이용하여 임상용 시제품인 Di-Wrinkle Free Cream (이하 DWFC로 표기, 50 g)을 Table 2와 같은 조성으로 생산하여 세명대학교 한방바이오 임상지원센터에서 주름 개선 임상 평가를 실시하였다.
- 항산화 활성이 가장 우수한 30 % 에탄올 사매추출물의 콜라게네이즈 효소 활성 측정은 NIH-3T3 cells line을 이용하여 세포 배양액으로부터 human MMP-8 immunoassay kit (QuantikineⓇ, DMP800, USA)를 사용하여 사매추출물의 콜라게네이즈 억제 효과를 측정하였다.
대상 데이터
- 대조군인 비타민 C 유도체인 trolox의 ORACPE 수치를 1로 볼 때 30 % 에탄올 사매추출물의 ORACPE 값은 trolox 수치 보다 월등히 우수함을 확인하였다. 따라서 30 % 에탄올 사매추출물을 실험 대상으로 선정하여 차후 실험 시료로 사용하였다.
- 본 인체적용시험은 세명대학교 임상윤리위원회의 승인 후에 실시하였으며, 본 실험에 참가한 사람은 건강하고 병력이 없는 피부를 가진 한국인 여성 21명을 대상으로 8주간 사용하게 하였다. 실험에 참여한 피험자의 평균연령은 45세, 표준 편차는 3.
- 28이었다. 시험 도중 다음과 같은 이상반응 및 그 밖의 이유로 탈락한 피험자는 없었으며 최종 피험자 수는 21명이었다. 피험자 방문 시 마다 이상반응(홍반, erythema), 부종(edema), 인설(scaling), 가려움(itching), 자통(stinging), 작열감(burning), 뻣뻣함(tightness), 따끔거림(pricking)이나 다른 이상반응이 발생하는지 육안평가와 문진으로 평가하였으며, 자극 증세 혹은 증상이 없었는지, 약한 정도인지, 중간 정도인지, 심한 정도인지를 구분하여 기록하였다.
- 실험에 사용한 사매는 서울 경동시장에서 국내산을 구입하였다. 사매 20 g를 에탄올 농도별(0, 30, 50, 70, 100%) 200 mL로 70 ℃에서 18 h 동안 추출하여 Filter paper No.
데이터처리
- 통계적 분석은 SPSS 등 통계처리 sofeware을 이용하여 기술적 통계분석을 실시하며 통계적 유의수준 p <0.05로 정하는 것을 원칙으로 하였다.
- 피험자의 눈가 주름 정도를 PRIMOS를 이용하여 평가하였다. 제품 도포 전(0주), 제품 도포 후 4주, 제품 도포 후 8주 경과 후에 임상센터에 방문한 피험자들을 대상으로 눈가의 주름 정도를 PRIMOS 전용 software를 사용하여 평가하였다.
이론/모형
- 본 실험에서 에탄올 농도별로 추출한 사매추출물의 항산화 활성을 알아보기 위하여 ORAC법으로 항산화 효과를 측정한 결과 물 추출물을 제외한 추출물에서 모두 대조군인 trolox 보다 항산화 효과가 우수하였지만, 특히 30 % 에탄올 사매추출물에서 가장 우수한 효과를 나타내었다(Table 1). ORACPE 수치는 실험방법에 표기한 수식을 이용하여 계상하였다. 대조군인 비타민 C 유도체인 trolox의 ORACPE 수치를 1로 볼 때 30 % 에탄올 사매추출물의 ORACPE 값은 trolox 수치 보다 월등히 우수함을 확인하였다.
성능/효과
- In vitro assay를 통하여 사매추출물의 주름 개선 효과를 확인하였으나, 실제 사람의 피부 주름 개선에 영향을 주는지 확인하기 위하여 사매추출물 1 %를 함유한 DWFC 을 이용하여 인체적용시험을 실시한 결과 DWFC는 피부 자극이 없으면서, 피부 기기평가와 피험자 자가진단 평가를 통하여 매우 우수한 주름 개선 효과를 보였다.
- In vitro 실험에서 사매추출물의 항산화 및 콜라게네이즈를 억제시키는 효과를 확인하였으며, 이는 간접적으로 콜라겐 생성 촉진 효과가 있는 것으로 판단된다. 따라서 실제적으로 사람의 피부 주름 개선에 영향을 주는지 확인하기 위하여 사매추출물을 1 % 함유한 DWFC에 대하여 인체 적용 시험을 실시하였다.
- PRIMOS를 이용한 주름 parameter인 R3z 값 전체를 paired t-test를 통해 DWFC 제품 전후간의 유의성 여부를 가설 평균 차 5 % (* p < 0.05)로 확인한 결과 DWFC 제품 사용 8주 후 약 13.0 %가 개선되었으며 이는 시험 제품 사용 후 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(Figure 3A).
- ORACPE 수치는 실험방법에 표기한 수식을 이용하여 계상하였다. 대조군인 비타민 C 유도체인 trolox의 ORACPE 수치를 1로 볼 때 30 % 에탄올 사매추출물의 ORACPE 값은 trolox 수치 보다 월등히 우수함을 확인하였다. 따라서 30 % 에탄올 사매추출물을 실험 대상으로 선정하여 차후 실험 시료로 사용하였다.
- 특히 항산화 활성이 가장 우수한 30 %에탄올 사매추출물을 이용하여 피부 섬유아세포에 대한 세포 독성을 조사한 결과 세포 독성은 나타나지 않았다. 또한 사매추출물의 콜라게네이즈 억제 활성을 조사한 결과 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인하였다. 사매 추출물은 항산화 활성뿐만 아니라, 피부 섬유아세포에 대한 무독성 및 collagenase을 억제함으로써 피부 내 콜라겐 생합성을 촉진하여 피부 주름 개선에 효과가 있음을 확인하였다.
- 본 실험에서 에탄올 농도별로 추출한 사매추출물의 항산화 활성을 알아보기 위하여 ORAC법으로 항산화 효과를 측정한 결과 물 추출물을 제외한 추출물에서 모두 대조군인 trolox 보다 항산화 효과가 우수하였지만, 특히 30 % 에탄올 사매추출물에서 가장 우수한 효과를 나타내었다(Table 1). ORACPE 수치는 실험방법에 표기한 수식을 이용하여 계상하였다.
- 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조 지지와 탄력증가의 역할을 하며, 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소 및 분해율이 증가되어 피부 진피층의 함몰을 초래하며 collagenase의 활성이 감소하는 것으로 알려져 있다[5,6]. 본 실험은 30 % 에탄올 사매 추출물의 콜라겐 분해 활성(collagenase activity)에 대한 것으로 collagenase (MMP-8) activity를 조사한 결과 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, 사매 추출물이 콜라겐 추출물해 활성을 감소시켜 분해도 증가되는 형성을 억제하는 효과가 있는 것을 확인하였다(Figure 2). Table 1의 항산화 효과 및 콜라게네이즈 억제 효과와 관련해 볼 때 30 % 사매추출물은 free radical 생성 억제뿐만 아니라, 콜라게네이즈의 발현을 억제하므로 콜라겐 생성 촉진 효과에 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 또한 사매추출물의 콜라게네이즈 억제 활성을 조사한 결과 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인하였다. 사매 추출물은 항산화 활성뿐만 아니라, 피부 섬유아세포에 대한 무독성 및 collagenase을 억제함으로써 피부 내 콜라겐 생합성을 촉진하여 피부 주름 개선에 효과가 있음을 확인하였다.
- 에탄올 농도별로 추출한 사매추출물의 항산화 평가는 ORAC 기법을 이용하여 항산화 활성을 조사한 결과 물 추출물 또는 100 % 에탄올 추출물에서 대조군인 비타민 E의 유도체 trolox에 비해 낮은 항산화 효과를 보였지만, 30 %, 50 %, 70 % 에탄올 추출물에서는 우수한 항산화 활성을 보였다. 특히 항산화 활성이 가장 우수한 30 %에탄올 사매추출물을 이용하여 피부 섬유아세포에 대한 세포 독성을 조사한 결과 세포 독성은 나타나지 않았다.
- 에탄올 농도별로 추출한 사매추출물의 항산화 평가는 ORAC 기법을 이용하여 항산화 활성을 조사한 결과 물 추출물 또는 100 % 에탄올 추출물에서 대조군인 비타민 E의 유도체 trolox에 비해 낮은 항산화 효과를 보였지만, 30 %, 50 %, 70 % 에탄올 추출물에서는 우수한 항산화 활성을 보였다. 특히 항산화 활성이 가장 우수한 30 %에탄올 사매추출물을 이용하여 피부 섬유아세포에 대한 세포 독성을 조사한 결과 세포 독성은 나타나지 않았다. 또한 사매추출물의 콜라게네이즈 억제 활성을 조사한 결과 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
- 섬유아세포에서 사매추출물의 처리가 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포 생존율을 측정하였다(Figure 1). 피부를 구성하는 주 단백질인 콜라겐은 피부진피에 존재하는 섬유아세포에서 합성이 되는데, 30 % 에탄올 사매추출물은 피부 섬유아세포에 대한 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 일반적으로 피부 주름을 형성하는 원인 중 하나로 피부교원질(콜라겐)의 결핍 또는 콜라겐 분해 활성 증가로 주름이 형성된다.
후속연구
- 결론적으로 사매추출물은 주름개선에 탁월한 효과를 보이는 천연 소재로 판단되며, 향후 기능성 화장품 원료로 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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