Bone maintains its homeostasis through balance between bone resorbing osteoclasts and bone forming osteoblasts. Thus, unusual balance between osteoclasts and osteoblasts leads to pathological bone diseases, such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, autoimmune arthritis, periodontitis. Schisandra c...
Bone maintains its homeostasis through balance between bone resorbing osteoclasts and bone forming osteoblasts. Thus, unusual balance between osteoclasts and osteoblasts leads to pathological bone diseases, such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, autoimmune arthritis, periodontitis. Schisandra chinensis well known traditional herbal has been used for treatment of diseases in China, Korea, Japan, andothers. Recently, research studies have demonstrated that the lignans found in Schisandra chinensis stimulate osteoblasts and suggest that it may be helpful against osteoporosis. However, the inhibitory effect of water extract of Schisandra chinensis on osteoclast differentiation remains largely unknown. In this study, Water extract of Schisandra chinensis markedly suppressed RANKL-induced osteoclast differentiation in cultures of BMMs without cytotoxicity. The mRNA expression of c-Fos, NFATc1, and TRAP induced by RANKL was inhibited by water extract of Schisandra chinensis. It also suppressed c-Fos and NFATc1 protein expression. Taken together, these results suggest that water extract of Schisandra chinensis has the potential to serve as a treatment of bone disease such as osteoporosis.
Bone maintains its homeostasis through balance between bone resorbing osteoclasts and bone forming osteoblasts. Thus, unusual balance between osteoclasts and osteoblasts leads to pathological bone diseases, such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, autoimmune arthritis, periodontitis. Schisandra chinensis well known traditional herbal has been used for treatment of diseases in China, Korea, Japan, andothers. Recently, research studies have demonstrated that the lignans found in Schisandra chinensis stimulate osteoblasts and suggest that it may be helpful against osteoporosis. However, the inhibitory effect of water extract of Schisandra chinensis on osteoclast differentiation remains largely unknown. In this study, Water extract of Schisandra chinensis markedly suppressed RANKL-induced osteoclast differentiation in cultures of BMMs without cytotoxicity. The mRNA expression of c-Fos, NFATc1, and TRAP induced by RANKL was inhibited by water extract of Schisandra chinensis. It also suppressed c-Fos and NFATc1 protein expression. Taken together, these results suggest that water extract of Schisandra chinensis has the potential to serve as a treatment of bone disease such as osteoporosis.
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문제 정의
환자의 치료에 가장 많이 사용되는 약물임에도 불구하고 식도염이나 하악골의 무혈성 괴사로 인한 부작용 등이 있어 사용에 제한이 있다14). 이로 인해 골다공증 치료에 효과 있는 천연물 발견의 필요성이 대두 되고 있는데 이전 연구에 국내에서 여러 가지 용도로 사용되고 있는 오미자가 조골세포를 활성화 시킨다는 결과가 보고되고 있어11) 골다공증 치료에 응용될 수 있는 가능성을 발견하고 골 흡수를 일으키는 파골세포 분화에 미치는 영향을 연구하였다. 파골세포의 분화를 억제하는 것은 병적인 골 소실을 억제하는 주된 전략이 될 수 있다.
최근에 연구를 통해 오미자가 함유한 lignan이 조골세포를 활성화에 기여한다는 결과가 보고되어12) 골다공증에 오미자의 역할이 중요할 것으로 추정되고 있는데 파골세포 분화에 대해서는 아직 연구된 바가 없는 실정이다. 이에 본 저자는 우리나라에서 흔하게 접할 수 있는 천연물인 오미자가 파골세포 분화에 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
제안 방법
분리된 골수세포는 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된α-minimum essential medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) (α-MEM) 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였고, 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 첨가하여 배양하고 오미자 물 추출물을 각각 농도 별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골 세포로 간주하였다.
이후 적절한 1차 항체를 처리하고 TBS-T 완충용액으로 세척한 후 2차 항체를 처리했다. TBS-T 완충용액으로 세척한 PVDF 막은 enhanced chemiluminescence를 이용해 단백질 발현을 관찰했다.
4). 그리고 이러한 오미자 추출물의 c-Fos와 NFATc1 단백질의 억제 효과는 오미자 추출물의 농도와 비례하였다(Fig. 5). 따라서 오미자 물 추출물에 의한 파골세포 분화 억제 효과는 c-Fos, NFATc1 발현 억제효과 때문일 것으로 생각된다.
대식세포를 오미자 물 추출물로 전처리 후 RANKL에 의한 MAPKs와 I-κB의 활성을 시간별로 확인했다.
특히 파골세포 분화에 중요한 유전자인 c-Fos와 NFATc1, TRAP 같은 물질이 파골세포의 분화에 필수적이므로 c-Fos와 NFATc1, TRAP의 mRNA 발현을 살펴보았다. 또한 RANKL에 의한 c-Fos와 NFATc1 단백질의 발현에 오미자물 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. RANKL은 c-Fos, NFATc1, TRAP의 mRNA발현을 촉진하였지만, 오미자 물 추출물을 처리한 실험군에서는 이들 유전자의 발현을 강력하게 억제하였다(Fig.
본 연구에는 오미자를 물로 추출하여 감압 농축한 후 동결건조하여 파우더 형태로 얻은 것을 사용하였다. Human M-CSF 와 RANKL은 Peprotech (London, UK)에서 구입했다.
RNA는 배양된 각각의 세포에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리했다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)를 이용해 cDNA 로 합성했다. 합성된 cDNA는 다음과 같은 primer를 이용하여 PCR 증폭을 했다.
골 흡수에 직접적인 영향을 미치는 세포가 파골세포이므로 파골세포의 분화는 골다공증 유발에 중요하게 작용한다. 저자는 파골세포의 분화에 오미자 물 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위해서 대식세포에 파골세포 분화에 필수적인 M-CSF와 RANKL 를 처리하고 오미자 물 추출물을 농도 별로 처리한 후 4일간 배양했다. M-CSF와 RANKL만을 처리한 대조군 에서는 TRAP 양성 다핵 형 파골 세포가 많이 생성되었으나 오미자 물 추출물을 같이 처리한 실험군 에서는 농도의 증가에 따라 TRAP 양성 파골 세포의 형성이 억제되었다(Fig.
RANKL과 RANK의 결합은 파골세포 분화에 필수적인 유전자 발현을 가능하게 한다. 특히 파골세포 분화에 중요한 유전자인 c-Fos와 NFATc1, TRAP 같은 물질이 파골세포의 분화에 필수적이므로 c-Fos와 NFATc1, TRAP의 mRNA 발현을 살펴보았다. 또한 RANKL에 의한 c-Fos와 NFATc1 단백질의 발현에 오미자물 추출물이 미치는 영향을 실험하였다.
파골세포 분화를 억제하는 오미자 물 추출물의 작용기전을 규명하기 위해 RANKL에 의한 MAPKs와 I-κB의 활성에 미치는 오미자 물 추출물의 효과를 검증하였다.
대상 데이터
5주령 ICR 생쥐의 넙적다리 뼈와 정강이 뼈를 분리하고 뼈 속질 공간을 1cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된α-minimum essential medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) (α-MEM) 배지에서 3일간 배양하였다.
Human M-CSF 와 RANKL은 Peprotech (London, UK)에서 구입했다. Actin 항체와 TRAP 용액은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. Phospho (p)-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38, P38, I-κB에 대한 항체는 Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA)의 제품을 사용했다.
본 연구에는 오미자를 물로 추출하여 감압 농축한 후 동결건조하여 파우더 형태로 얻은 것을 사용하였다. Human M-CSF 와 RANKL은 Peprotech (London, UK)에서 구입했다. Actin 항체와 TRAP 용액은 Sigma (St.
Phospho (p)-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38, P38, I-κB에 대한 항체는 Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA)의 제품을 사용했다.
XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA)사에서 구입했다. c-Fos와 NFATc1에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
정량적인 결과들은 평균 ± 표준편차로 표시했으며 Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하여 별표 (*)표시하였다.
성능/효과
(A) BMMs were cultured for 4 days with M-CSF (30 ng/㎖) and RANKL (50 ng/㎖) in the presence of water extract of Schisandra chinensis. Cells were fixed in 3.
4. 파골세포 분화에 중요한 신호 전달 물질 활성에 미치는 오미자 물 추출물의 효과.
내에서 여러 가지 효능을 위해 사용되어 왔던 오미자를 가지고 실험한 결과 파골세포 분화의 중요 경로인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제함을 밝혀내었고 이로 인해 염증성 골 소실이나 폐경 이후 골다공증의 예방과 치료에 도움이 될 것으로 판단된다. 특히 화학적인 물질이 아닌 천연물로서 효과적인 골다 공증 치료에 효과적이라면 향후 지속적인 연구와 임상적인 적용이 필요할 것으로 여겨진다.
3). 또한 RANKL을 처리한 대조군은 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현이 증가되었지만 오미자 물 추출물을 같이 처리한 실험군의 c-Fos와 NFATc1 단백질의 발현은 대조군과 비교했을 때 억제되었다(Fig. 4). 그리고 이러한 오미자 추출물의 c-Fos와 NFATc1 단백질의 억제 효과는 오미자 추출물의 농도와 비례하였다(Fig.
c-Fos는 AP-1 이합체의 주요한 인자로 RANKL에 의해 발현이 증가되며 c-Fos와 knock-out 생쥐의 세포는 파골세포의 형성이 억제된다고 보고되어 c-Fos의 발현의 중요성을 증명해 주고 있다20). 본 실험을 통하여 오미자 추출물이 세포 독성이 없는 용량에서 파골세포로의 분화를 현저하게 억제하는 결과를 확인하였고, 또한 이러한 파골세포 분화 억제 효과는 주된 경로인 c-Fos와 NFATc1 의 발현 억제를 통해 이루어짐을 확인하였다. NFATc1은 c-Fos와 Ca2+/calmodulin activated kinases (CaMKs) 신호전달 체계에 의해 활성화 되지만 RANKL 의 자극이 없이도 NFATc1을 과도하게 발현시킨 전구세포는 TRAP 양성 세포로 분화 되어 파골세포 분화에 NFATc1이 핵심 물질임이 증명되었다21).
p38 이외에 JNK 등도 파골세포의 분화와 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다25). 본 연구 결과를 살펴보면 p38, JNK, ERK 등의 MAPK 경로에 오미자 추출물이 영향을 미치지 않았다. 오미자 추출물이 c-Fos와 NFATc1의 현저한 발현 억제 작용을 하면서 MAPK 경로에 영향을 주지 않았다는 결과는 일반적으로 알려져 있지 않은 사실이다.
2). 이 결과로 오미자 물 추출물이 세포 독성 없이 파골세포의 분화를 억제한다고 할 수 있다.
6). 이를 통해 오미자 추출물의 파골세포 분화 억제 효과는 p38, JNK, ERK의 신호전달경로 활성과는 별다른 연관성이 없을 것으로 판단된다.
1B). 이를 통해 오미자의 추출물에서 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
오미자는 그 동안의 연구를 통해서 간염이나 만성 간질환에 효과가 있고15), 항 증식 효과를 통한 항암 효과가 있다고도 보고되었다16). 증식하는 세포에 작용하지만 정상적인 세포에는 어떠한 부작용도 보고되지 않아 안전한 천연물로 알려져 있는데 본 실험에 사용된 용량의 오미자에서는 XTT결과에서 세포 독성은 확인되지 않았다. 파골세포 분화 및 활성화에 RANKL과 RANK의 결합이 필수적이며17), 이를 통해 c-Fos와 NFATc1의 발현이 증가하게 되는 경로가 파골 세포로의 분화에 주된 기전이다18,19).
후속연구
오미자 추출물이 c-Fos와 NFATc1의 현저한 발현 억제 작용을 하면서 MAPK 경로에 영향을 주지 않았다는 결과는 일반적으로 알려져 있지 않은 사실이다. 이 점에서 오미자의 파골 세포 분화에 미치는 영향이 RANKL과 RANK의 결합 이후 중요 전사인자인 c-Fos와 NFATc1를 MAPK 경로와 무관하게 나타나는 근거로 오미자 추출물의 파골세포 분화 억제 작용에 대한 중요한 다른 기전이 있을 가능성이 있을 것으로 추정되며 좀 더 심도 깊은 연구가 필요하다고 생각된다.
내에서 여러 가지 효능을 위해 사용되어 왔던 오미자를 가지고 실험한 결과 파골세포 분화의 중요 경로인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제함을 밝혀내었고 이로 인해 염증성 골 소실이나 폐경 이후 골다공증의 예방과 치료에 도움이 될 것으로 판단된다. 특히 화학적인 물질이 아닌 천연물로서 효과적인 골다 공증 치료에 효과적이라면 향후 지속적인 연구와 임상적인 적용이 필요할 것으로 여겨진다. 또한 이전에 보고된 조골세포 활성화 기능과 본 저자의 파골세포 분화 억제 작용은 골다공증의 치료에 상호 보완적 효과가 있어 기존에 알려진 어떤 후보 물질보다 가능성이 있는 물질이라 하겠다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
파골세포는 무엇인가?
파골세포는 조혈모세포에서 유래되는 다형핵 세포이며 대식세포계의 세포이다. 파골세포로의 분화는 실제적인 골 흡수에 매우 중요한 과정이며 파골세포로의 분화를 매개하는 주된 신호물질은 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)이다3).
파골세포로의 분화를 매개하는 주된 신호물질인 RANKL은 무슨 역할을 하는가?
파골세포로의 분화는 실제적인 골 흡수에 매우 중요한 과정이며 파골세포로의 분화를 매개하는 주된 신호물질은 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)이다3). RANKL은 파골 전구세포의 표면에 발현된 RANK와 결합하여 파골세포 분화에 필수적인 역할을 하는 NF-κB, c-Fos, Nuclear factor of activated T cell c1 (NFATc1)과 같은 물질의 발현을 유도한다4). c-Fos는 RANKL에 의해 유도되어 파골세포에 특이적인 유전물질인 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)의 발현을 유도하는 중요한 NFATc1의 발현을 유도한다5).
염증성 질환의 골 소실과 밀접한 연관이 있는 현상은 무엇인가?
뼈는 지속적으로 흡수되고 새롭게 생성되는 재 조합 과정을 거치는 조직으로 골 흡수를 야기하는 파골세포와 골 생성 기능을 가진 조골세포 간의 균형이 중요하다1). 특히 파골세포의 기능이 비정상적으로 항진된 경우 골 파괴가 증가되어 골다공증이 야기되며 이런 현상은 류마티스 관절염 같은 염증성 질환의 골 소실과 밀접한 연관이 있다2).
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