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문제 정의
- 그러나, 천화분 약침액에 대한 폐암연구는 진행된 바가 미비하기에 세포생존율, Hoechst 33342 염색을 통한 핵의 분절화, 세포주기변화 분석, Bcl-2, Bax 등의 세포사멸 유관 단백질 수준을 조사하여유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 1. 천화분 약침액은 농도의존적으로 세포생존율을 감소시킨다.
- 2. 천화분 약침액은 핵의 분절화를 일으킨다.
제안 방법
- 방법에 의하여 실시하였다. 24 well 배양용기에 HT-29세포를 5☓104 cells/ml 개씩 분주하고 24 시간 후에 천화분 약침액을 농도별(0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ㎍/mL) 처리하고 72 시간 동안 배양한 후 상층액을 버리고 당일 제조한 0.05% MTT를 배양용기에 분주한 후 72 시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 실온에서 10 분간 DMSO에 formazan 침전물을 녹인 후 ELISA reader로 흡광도 570nm에서 측정하여 대조군과 비교하였다.
- Caspase는 initiator caspase와 effector caspase로 구분되며, initiator caspase는 death-inducing signal에 의해 활성화되어 effector caspase를 활성화하고 활성화된 effector caspase는 lamin A, a-fodrin, DNA fragmentation factor와 PARP 등의 단백질을 분해하여 세포사멸을 유도한다15,16). Caspase family 중 caspase-3 활성정도를 알아보기 위하여 전구물질인 procaspase-3의 활성정도를 측정하였다(Fig. 5). 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, procaspase-3 단백질 발현을 관찰하였다.
- HT-29 세포를 1×106 cell/dish의 밀도로 100㎜ dish에 분주하였고, 위의 방법대로 천화분 약침액을 처리하여 48시간 또는 72시간을 배양한 후 수거하여, PBS로 2회 세척한 후 각각의 세포에 세포용해 완충용액(10mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X, 1mM PMSF, 1㎍/mL aprotinin, 1㎍/mL leupeptin, 1mM DTT)을 첨가하여 세포를 용해하여 Bradford(Bio-rad, USA) 방법을 이용하여 단백질 정량을 하였다.
- HT-29 세포를 10% FBS가 첨가된 배지로 희석하여 5☓104 cells/ml의 밀도로 6 cm dish에 분주한 후 24시간이 지난 후 천화분 약침액(0, 100, 200, 300 ㎍/mL)을 처리하였다. 천화분 약침액을 처리하여 세포를 72 시간 배양한 후 차가운 PBS로 세포단층을 씻어낸 후 4% formaldehyde로 세포를 고정하였다.
- 05% MTT를 배양용기에 분주한 후 72 시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고 실온에서 10 분간 DMSO에 formazan 침전물을 녹인 후 ELISA reader로 흡광도 570nm에서 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 세포에 10 ㎍/mL Hoechst 33342 용액을 넣어 어두운 곳에서 1 시간 염색하였다. 세포를 PBS로 충분히 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다25).
- 1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 후 secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL western blotting detection reagent(Amersham)으로 반응 시킨 후 ChemiDoc image 분석기기(Bio-rad, USA)를 이용하여 관찰하였다.
- . 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, PARP와 cleaved-PARP 단백질 발현을 관찰하였다. 천화분 약침액 각 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 PARP 단백질 발현은 감소되는 결과가 관찰되었고, 이와 반대로 cleaved-PARP 단백질 발현의 증가가 관찰되었다(Fig.
- . 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, p21 단백질 발현을 관찰하였다. 천화분 약침액 50 ㎍/㎖ 농도에서 p21 단백질 발현이 증가(Fig.
- 5). 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, procaspase-3 단백질 발현을 관찰하였다. 천화분 약침액 각 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 procaspase-3 단백질 발현의 감소가 관찰되었다(Fig.
- 천화분 약침액을 A549 폐암 세포에 다양한 농도(0, 50, 100, 150, 200 ㎍/mL)로 첨가하여 72시간 배양한 후 MTT assay를 실시하여 살아 있는 세포를 측정하였다. A549 세포의 증식은 50 ㎍/mL 농도로 천화분 약침액을 처리한 경우 대조군에 비하여 79.
- cells/ml의 밀도로 6 cm dish에 분주한 후 24시간이 지난 후 천화분 약침액(0, 100, 200, 300 ㎍/mL)을 처리하였다. 천화분 약침액을 처리하여 세포를 72 시간 배양한 후 차가운 PBS로 세포단층을 씻어낸 후 4% formaldehyde로 세포를 고정하였다. 세포에 10 ㎍/mL Hoechst 33342 용액을 넣어 어두운 곳에서 1 시간 염색하였다.
- 천화분 약침액의 항암효과를 확인하기 위하여 A549 폐암 세포를 배양한 후 천화분 약침액을 농도별로 처리하여 세포생존율, 핵모양, p21과 p53단백질 발현, Bcl-2와 Bax 단백질 발현, procaspase-3와 PARP 단백질 발현 등의 변화를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- A549세포주는 한국세포주 은행(KCLB)에서, 세포배양에 사용한 RPMI 1640, Fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin, Trypsin-EDTA는 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), Hoechst H 33258, propidium iodide와 본 연구에서 일반적인 시약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서, Annexin V-FITC(fluorescein isocyanate)/propionium iodide(PI) apoptosis detection kit(BD bioscience. USA)은 BD Pharmingen(Franklin Lakes, NJ, USA)에서, Bcl-2, Bax, caspase-3, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)에 대한 antibody는 Santa Cruz Biotech(MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 생약재인 천화분은 (주)옴니허브에서 구입하여, 천화분 600g에 물 6,000 ml를 가하여 2시간 동안 끓인 후, 냉침 시켜 filter로 여과하여 감압 농축 후 시료를 얻어 냉장 보관하였으며, 시료는 분주하여 물에 녹인 후 Φ 0.2㎛ 필터를 사용하였다.
- 세포는 RPMI1640 배지에 10% FBS, 100 units/㎖ penicillin과 100 ㎍ streptomycin을 첨가한 세포 배양액을 사용하여 37℃, CO2 incubator(5% CO2/95% air)에서 배양하였다.
데이터처리
- 수집된 결과는 Origin 5.0 (USA)를 이용하여 분석되었으며, 각 실험군의 평균치간의 유의성은 Student's t-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- cells/well in RPMI 1640 supplemented with 10% FBS. Cell viability were estimated by the MTT assay. Each bar represents the mean ± SD (n=6).
- 세포생존율 측정은 Mosmann24) 방법에 의하여 실시하였다. 24 well 배양용기에 HT-29세포를 5☓104 cells/ml 개씩 분주하고 24 시간 후에 천화분 약침액을 농도별(0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 ㎍/mL) 처리하고 72 시간 동안 배양한 후 상층액을 버리고 당일 제조한 0.
성능/효과
- 4. 천화분 약침액은 Bcl-2 단백질 발현을 감소시키며, Bax 단백질 발현에는 영향을 주지 못한다.
- 6). 결과적으로 PARP의 활성화가 천화분 약침액의 농도증가에 따라 증가되는 점으로 보아 천화분 약침액은 PARP 활성화를 통하여 apoptosis를 유도하는 것으로 사료된다.
- Pro-apoptotic 단백질로 알려진 Bax의 경우, 감송향 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도에서 각각 Bax 단백질 발현의 증가 또는 감소가 관찰되지 않았다(data not show). 따라서 Bax의 발현 증가되지는 않았지만 Bcl-2의 감소로 미토콘드리아 막의 투과성을 증가시켜 cytochrome c의 방출을 증가시켜 세포사멸을 유도할 것으로 사료된다.
- 1). 이러한 결과로 천화분 약침액이 A549 폐암 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다.
- 세포 사멸이 일어나면 형태학적 특징은 세포의 비중감소, 세포막의 파괴, 염색체의 응측 등과 더불어 세포내부의 물질들이 세포사멸체와 같은 형상의 출현이 증가한다. 이러한 특징을 알아보기 위하여 천화분 약침액을 농도별로 처리하고 72 시간 배양한 후 DNA에 특이적으로 결합하는 형광염색액인 Hoechst 33342를 사용하여 세포사멸의 형태학적특징을 관찰한 결과 A549 폐암 세포는 천화분 약침액에 대하여 농도 의존적으로 정상 대조군에 비하여 세포 개쳇수의 감소, 세포의 크기가 축소되었으며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
- 이상의 연구결과로 천화분 약침액은 apoptosis관련의 항암효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이상의 연구결과를 요약해보면 천화분 약침액은 농도의존적으로 세포생존율을 감소시키며 핵의 형태학상 변화에서는 핵의 분절화를 나타내고 있다. 또한 apoptosis 유관인자인 p21과 p53 단백질 발현의 증가를 가져오고, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 단백질 발현을 감소시키며 pro-apoptotic 인자인 Bax 단백질 발현에는 영향을 주지 못한다.
- 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, PARP와 cleaved-PARP 단백질 발현을 관찰하였다. 천화분 약침액 각 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 PARP 단백질 발현은 감소되는 결과가 관찰되었고, 이와 반대로 cleaved-PARP 단백질 발현의 증가가 관찰되었다(Fig. 6). 결과적으로 PARP의 활성화가 천화분 약침액의 농도증가에 따라 증가되는 점으로 보아 천화분 약침액은 PARP 활성화를 통하여 apoptosis를 유도하는 것으로 사료된다.
- Pro-apoptotic Bcl-2 family 단백질과 BH3-only Bcl-2 family 단백질은 미토콘드리아 막의 탈분극을 억제하여 막투과성을 감소시켜 cytochrome C의 방출을 억제하여 세포사멸을 억제한다29). 천화분 약침액이 Bcl-2 단백질 수준에 미치는 영향을 알아보기 위하여 A549 세포에 천화분 약침액을 0, 50, 100, 150, 200㎍/㎖의 농도로 72시간 배양한 후, anti-apoptotic단백질인 Bcl-2 단백질 발현을 관찰한 결과, 천화분 약침액 각 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖ 농도에서 Bcl-2 단백질 발현의 증가 또는 감소가 관찰되었다(Fig. 4). Pro-apoptotic 단백질로 알려진 Bax의 경우, 감송향 약침액을 0, 50, 100, 150, 200 ㎍/㎖의 농도에서 각각 Bax 단백질 발현의 증가 또는 감소가 관찰되지 않았다(data not show).
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