[논문]Bacillus cereus에서 유래한 Lactate Dehydrogenase 동질효소 유전자의 대장균 내 발현 및 효소특성 규명

장명운; 박정미; 이홍균; 이소라; 김태집

[국내논문] Bacillus cereus에서 유래한 Lactate Dehydrogenase 동질효소 유전자의 대장균 내 발현 및 효소특성 규명
Enzymatic Characterization of Bacillus cereus Lactate Dehydrogenase Isozymes Expressed in Escherichia coli 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.46 no.2, 2010년, pp.213 - 218

장명운 (충북대학교 식품공학과) , 박정미 (충북대학교 식품공학과) , 이홍균 (충북대학교 식품공학과) , 이소라 (충북대학교 식품공학과) , 김태집 (충북대학교 식품공학과)

초록
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Lactate dehydrogenases (LDHs)는 세포 내의 생화학적 대사경로에서 중요한 역할을 담당하는 효소로서 오랜 동안 많은 관심을 받았다. 본 연구에서는 다양한 미생물 genome database의 탐색을 통해 Bacillus cereus ATCC 14579 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하고, 대장균에서 클로닝 및 대량 발현하였다. 모든 BcLDH 동질효소들의 상동부위 아미노산 잔기 대부분이 기존의 $NAD^+$-의존형 LDH와 높은 상동성을 보였다. 한편 314개의 아미노산으로 이루어진 BcLDH1과 2는 86%의 서열 상동성을 보였으나, BcLDH3와는 49%의 상동성을 나타냈다. 흥미롭게도 BcLDH1만이 $NAD^+$ 조효소 존재 하에서 L-lactate와 pyruvate 간의 상호전환 활성을 나타냈으며, 그 외의 동질효소들은 거의 활성을 보이지 않았다. 결론적으로 BcLDH1은 전형적인 $NAD^+$-의존형이며, L-lactate에 특이적인 dehydrogenase 효소임을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Lactate dehydrogenases (LDHs) have been highly focused for long time, due to their important roles in biochemical and metabolic pathways of cells. On the basis of genome-wide searching results, three putative LDH genes from Bacillus cereus ATCC 14579 genome have been PCR-amplified, cloned, and well-expressed in E. coli. All three BcLDH isozymes are supposed to share highly conserved catalytic amino acid residues in common $NAD^+$-dependent LDHs. Meanwhile, BcLDH1 consisting of 314 amino acids shares 86 and 49% of identities with BcLDH2 and 3, respectively. Interestingly, only BcLDH1 showed the converting activities between L-lactate and pyruvate in the presence of $NAD^+$ coenzyme, while the other isozymes are likely to have almost no activity. As a result, it was revealed that BcLDH1 can be a typical $NAD^+$-dependent L-lactate-specific dehydrogenase.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 생물학적인 중요성이 매우 높으면서도 체계적인 유전적, 효소적 연구가 부족하였던 LDH 유전자의 특성을 규명하고자, B. cereus ATCC 14579 균주의 genome으로부터 3종의 LDH 추정 유전자를 클로닝하여 대장균에서 대량으로 발현하고, 다른 미생물 유래 LDH와의 비교를 통해 유전자 구조, 서열 상동성 및 효소특성 등의 유용한 정보를 제공하고자 하였다.

제안 방법

BcLDH1 유전자의 증폭을 위해 BcLDH1N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGGTAT TAACCGTG-3′)과 BcLDH1C (5′-TAAGCTTAAGAACCGG AGCCATTGTTTC-3′) primer set을 사용하였고, BcLDH2 유전자의 경우에는 BcLDH2N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGG TATCAATCGTG-3′)과 BcLDH2C (5′-TAAGCTTTAGTACT GGTGCCATTGTTTC-3′) primer로 증폭하였으며, BcLDH3 유전자는 BcLDH3N (5′-TGAATTCATGAAAAGACATACA AGAAAAATTG-3′)과 BcLDH3C (5′-TAAGCTTGTAACCA ATTGTTTTCATATAATC-3′)를 사용하였다.
25℃에서 10분 동안 효소반응을 진행하면서 PowerWave™ microplate spectrophotometer (BIOTEK, USA)를 이용하여 1분 간격으로 반응액의 흡광도(340 nm) 변화를 연속적으로 측정하였다.
각 BcLDH의 효소활성을 측정하기 위해 100 mM의 L-lactate기질, 5 mM NAD+ 조효소를 함유한 100 mM Tris-HCl buffer(pH 9.0)에 적당량의 정제된 효소를 첨가하여 최종 300 μl 로 반응하였다.
분자량 비교를 위해 High range protein molecular weight markers (Bio-Rad)를 표준물질로 사용하였으며, 효소 단백질의 농도는 BCA™ protein assay kit (Pierce Biotechnology, USA)를 이용하여 측정하였다.
파장 600 nm에서의 흡광도가 0.4-0.6에 도달한 후, 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside)를 첨가하여 LDH 효소의 발현을 유도(induction)하였으며, 이후 16시간이 될 때까지 배양하였다.
B. cereus의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 각 LDH 동질효소의 유전자를 선택적으로 증폭하였다. BcLDH1 유전자의 증폭을 위해 BcLDH1N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGGTAT TAACCGTG-3′)과 BcLDH1C (5′-TAAGCTTAAGAACCGG AGCCATTGTTTC-3′) primer set을 사용하였고, BcLDH2 유전자의 경우에는 BcLDH2N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGG TATCAATCGTG-3′)과 BcLDH2C (5′-TAAGCTTTAGTACT GGTGCCATTGTTTC-3′) primer로 증폭하였으며, BcLDH3 유전자는 BcLDH3N (5′-TGAATTCATGAAAAGACATACA AGAAAAATTG-3′)과 BcLDH3C (5′-TAAGCTTGTAACCA ATTGTTTTCATATAATC-3′)를 사용하였다.
BcLDH1 유전자의 증폭을 위해 BcLDH1N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGGTAT TAACCGTG-3′)과 BcLDH1C (5′-TAAGCTTAAGAACCGG AGCCATTGTTTC-3′) primer set을 사용하였고, BcLDH2 유전자의 경우에는 BcLDH2N (5′-TGGATCCATGAAAAAAGG TATCAATCGTG-3′)과 BcLDH2C (5′-TAAGCTTTAGTACT GGTGCCATTGTTTC-3′) primer로 증폭하였으며, BcLDH3 유전자는 BcLDH3N (5′-TGAATTCATGAAAAGACATACA AGAAAAATTG-3′)과 BcLDH3C (5′-TAAGCTTGTAACCA ATTGTTTTCATATAATC-3′)를 사용하였다. PCR 증폭은 Taq DNA polymerase (Roche Applied Science, Germany)와 Px2 thermal cycler (Thermo-Hybaid, UK)를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분간 추가로 증폭한 후 종료하였다. 증폭된 각 LDH 유전자는 pMD18-T Easy (TaKaRa Biomedical) 벡터에 클로닝 한 후, 서울대학교 유전체지원센터의 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)로 염기서열의 변이 여부를 검증하였다.
PCR 증폭은 Taq DNA polymerase (Roche Applied Science, Germany)와 Px2 thermal cycler (Thermo-Hybaid, UK)를 사용하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초로 30회 반복하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분간 추가로 증폭한 후 종료하였다. 증폭된 각 LDH 유전자는 pMD18-T Easy (TaKaRa Biomedical) 벡터에 클로닝 한 후, 서울대학교 유전체지원센터의 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)로 염기서열의 변이 여부를 검증하였다.
단백질 정량 및 분자량 측정

정제된 BcLDH 동질효소의 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. 전기영동에는 12% separating gel과 Miniprotean II kit (Bio-Rad, USA)를 사용하였으며, Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후, 다시 destaining solution(20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 단백질 band를 확인하였다.
정제된 BcLDH 동질효소의 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. 전기영동에는 12% separating gel과 Miniprotean II kit (Bio-Rad, USA)를 사용하였으며, Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후, 다시 destaining solution(20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 단백질 band를 확인하였다. 분자량 비교를 위해 High range protein molecular weight markers (Bio-Rad)를 표준물질로 사용하였으며, 효소 단백질의 농도는 BCA™ protein assay kit (Pierce Biotechnology, USA)를 이용하여 측정하였다.
LDH 효소의 lactate 산화활성을 나타내기 위해, 1 unit는 1분당 1 μmol의 NAD⁺를 NADH로 전환하는 효소의 양으로 정의하였다. 각 LDH 효소의 입체이성질체 기질에 대한 특이성 및 조효소 의존성을 확인하기 위해 각각 100 mM의 D-lactate 또는 L-lactate 기질 및 5 mM의 NAD⁺ 또는 NADP⁺의 서로 다른 조효소를 첨가한 후, 각 조합의 반응 중 효소활성 변화를 연속적으로 측정하였다.
gov)의 genome database에 대한 검색을 통해 자연계에 존재하는 다양한 미생물 유래 LDH 유전자의 분포를 확인하였다. Bacillus stearothermophilus LDH (BstLDH) 유전자(GenBank accession no. M14788)의 서열을 이용한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 상동성 검색 결과, B. cereus ATCC 14579의 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하였으며, 편의상 각 유전자를 bcldh1 (GenBank no. AAP08895), bcldh2 (AAP11769)와 bcldh3 (AAP11868)로 구별하였다.
B. cereus genomic DNA (ATCC 14579D) 주형과 각 유전자에 특이적인 PCR primer 조합을 사용하여 LDH 유전자를 증폭하였다. PCR 단편을 pMD-18T 벡터에 각각 삽입하고 pMDBcLDH1, pMDBcLDH2, pMDBcLDH3로 명명하였으며, M13 forward 및 reverse sequencing primer를 사용하여 BcLDH 추정 유전자들의 염기서열을 확인한 결과, 증폭된 유전자들의 염기서열은 database에서 발견된 서열과 정확히 일치함을 확인하였다.
BcLDH 추정 유전자들의 1차 구조를 분석하기 위하여, 이미 입체구조가 알려진 BstLDH의 구조와 상호 비교하였다(Fig. 1). 기존 연구(5, 6, 23)를 통해 제안된 활성 부위와 기질결합 부위 등을 포함하는 LDH의 상동부위 아미노산 잔기들이 대부분 BcLDH 추정 유전자 상에서도 동일한 위치에 존재함을 확인하였다.
대장균에서 대량 발현하기 위하여 B. cereus에서 유래한 3종의 LDH 추정 유전자들을 각각 발현벡터로 클로닝하였다. 우선, pMDBcLDH1과 2의 경우, 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단하고 pET-21a 발현벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드인 pETBcLDH1과 pETBcLDH2를 얻었으며, pETBcLDH3의 제조에는 EcoRI과 HindIII 제한효소를 사용하였다(Fig.
2). 이들 LDH 유전자는 IPTG의 첨가로 T7 RNA polymerase promoter에 의해 유도 발현되며, 효율적인 효소 정제를 위하여 6개의 연속적인 histidine 아미노산 잔기가 C-말단에 결합된 형태로 발현되도록 고안하였다. 각 플라스미드를 E.
이들 LDH 유전자는 IPTG의 첨가로 T7 RNA polymerase promoter에 의해 유도 발현되며, 효율적인 효소 정제를 위하여 6개의 연속적인 histidine 아미노산 잔기가 C-말단에 결합된 형태로 발현되도록 고안하였다. 각 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3)으로 형질전환하여 재조합 대장균을 얻은 후, 다시 LBA 액체배지에서 배양하여 효소를 생산하였으며, 조효소액을 Ni-NTA column에 통과시켜 최종적으로 정제된 BcLDH 동질효소들을 얻었다. 결과적으로 예상한 분자량과 일치하는 재조합 BcLDH1(34.
정제된 재조합 BcLDH 동질효소의 활성을 확인하기 위해 100 mM의 L-lactate를 기질로 포함한 100 mM Tris-HCl (pH 9.0) 완충용액에서 효소반응을 실시하였다. 일반적으로 LDH 효소가 lactate를 pyruvate로 전환하는 과정에서 조효소인 NAD⁺가 NADH로 환원됨에 따라 340 nm에서의 흡광도 값이 증가하므로, 본 연구에서는 시간의 경과에 따른 효소 반응액의 흡광도 증가 정도를 측정하여 효소의 활성을 측정하였다.
0) 완충용액에서 효소반응을 실시하였다. 일반적으로 LDH 효소가 lactate를 pyruvate로 전환하는 과정에서 조효소인 NAD⁺가 NADH로 환원됨에 따라 340 nm에서의 흡광도 값이 증가하므로, 본 연구에서는 시간의 경과에 따른 효소 반응액의 흡광도 증가 정도를 측정하여 효소의 활성을 측정하였다. BcLDH1의 경우, L-lactate 기질과 함께 5 mM의 NAD⁺를 조효소로 사용한 반응에서 pyruvate로의 전환을 촉매하는 활성을 나타내었으며(Fig.
Lactate dehydrogenases (LDHs)는 세포 내의 생화학적 대사경로에서 중요한 역할을 담당하는 효소로서 오랜 동안 많은 관심을 받았다. 본 연구에서는 다양한 미생물 genome database의 탐색을 통해 Bacillus cereus ATCC 14579 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하고, 대장균에서 클로닝 및 대량 발현하였다. 모든 BcLDH 동질효소들의 상동부위 아미노산 잔기 대부분이 기존의 NAD⁺-의존형 LDH와 높은 상동성을 보였다.
GenBank를 포함한 National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 genome database에 대한 검색을 통해 자연계에 존재하는 다양한 미생물 유래 LDH 유전자의 분포를 확인하였다. Bacillus stearothermophilus LDH (BstLDH) 유전자(GenBank accession no.

대상 데이터

본 연구에 사용된 일반 시약과 효소반응 기질 및 미생물 배지는 각각 Sigma-Aldrich (USA)와 Duchefa Biochemie (Netherlands)로부터 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 T4 DNA ligase 및 각종 제한효소들은 TaKaRa Biomedical (Japan)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 sequencing primer는 Bioneer(Korea)로부터 합성하였다.
본 연구에 사용된 일반 시약과 효소반응 기질 및 미생물 배지는 각각 Sigma-Aldrich (USA)와 Duchefa Biochemie (Netherlands)로부터 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 T4 DNA ligase 및 각종 제한효소들은 TaKaRa Biomedical (Japan)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 sequencing primer는 Bioneer(Korea)로부터 합성하였다. 또한 agarose와 GENECLEAN turbo nucleic acid purification kit는 Qbiogene (USA)에서, 단백질 정제에 사용한 Ni-NTA affinity column은 QIAGEN(Germany)에서 구입하여 사용하였다.
또한 agarose와 GENECLEAN turbo nucleic acid purification kit는 Qbiogene (USA)에서, 단백질 정제에 사용한 Ni-NTA affinity column은 QIAGEN(Germany)에서 구입하여 사용하였다. BcLDH 유전자의 PCR 클로닝에 주형으로 사용한 B. cereus 염색체 DNA (ATCC 14579D)는 한국생명공학연구원의 미생물프론티어 사업단으로부터 제공받았다.
BcLDH1과 BcLDH2 유전자는 BamHI과 HindIII 제한효소로 각각 처리하고, pET-21a (Novagen, Germany)에 삽입하여 최종 발현벡터인 pETBcLDH1과 pETBcLDH2를 얻었으며, pETBcLDH3의 제조를 위해서는 EcoRI과 HindIII 제한효소를 이용하였다. 각각의 재조합 플라스미드를 E.

성능/효과

cereus genomic DNA (ATCC 14579D) 주형과 각 유전자에 특이적인 PCR primer 조합을 사용하여 LDH 유전자를 증폭하였다. PCR 단편을 pMD-18T 벡터에 각각 삽입하고 pMDBcLDH1, pMDBcLDH2, pMDBcLDH3로 명명하였으며, M13 forward 및 reverse sequencing primer를 사용하여 BcLDH 추정 유전자들의 염기서열을 확인한 결과, 증폭된 유전자들의 염기서열은 database에서 발견된 서열과 정확히 일치함을 확인하였다.
각각의 BcLDH 유전자로부터 유추한 아미노산 서열의 상동성 비교 결과(Table 1), BcLDH1과 2의 상동성은 86.0%로 매우 높은 편이나, BcLDH3와의 상동성은 49.1%와 50.6%로 비교적 낮았다. 또한 다른 Bacillus 속 유래 LDH와 비교하였을 경우, B.
1). 기존 연구(5, 6, 23)를 통해 제안된 활성 부위와 기질결합 부위 등을 포함하는 LDH의 상동부위 아미노산 잔기들이 대부분 BcLDH 추정 유전자 상에서도 동일한 위치에 존재함을 확인하였다. 특히 효소활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Gln85 (BcLDH3의 경우 Pro85에 해당), Asp151, Arg154, His178 잔기 외에도, 기질결합에 관여하는 Arg91, Asp180, Thr232 잔기 또한 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다.
한편 fructose-1,6- bisphosphate (FBP)와 결합하여 allosteric 조절작용에 영향을 미치는 Arg156과 His171 잔기(5, 6) 또한 이들 유전자에서 동일하게 발견되었다. 따라서 본 연구에서 클로닝한 3종의 BcLDH 유전자들은 모두 LDH계열의 효소 유전자일 것으로 예상할 수 있었다.
coli BL21 (DE3)으로 형질전환하여 재조합 대장균을 얻은 후, 다시 LBA 액체배지에서 배양하여 효소를 생산하였으며, 조효소액을 Ni-NTA column에 통과시켜 최종적으로 정제된 BcLDH 동질효소들을 얻었다. 결과적으로 예상한 분자량과 일치하는 재조합 BcLDH1(34.8 kDa), BcLDH2 (34.6 kDa) 및 BcLDH3 (34.7 kDa) 효소가 대장균 내에서 성공적으로 대량 발현되었으며, 높은 순도와 효율로 신속하게 정제됨을 확인하였다(Fig. 3).
일반적으로 LDH 효소가 lactate를 pyruvate로 전환하는 과정에서 조효소인 NAD⁺가 NADH로 환원됨에 따라 340 nm에서의 흡광도 값이 증가하므로, 본 연구에서는 시간의 경과에 따른 효소 반응액의 흡광도 증가 정도를 측정하여 효소의 활성을 측정하였다. BcLDH1의 경우, L-lactate 기질과 함께 5 mM의 NAD⁺를 조효소로 사용한 반응에서 pyruvate로의 전환을 촉매하는 활성을 나타내었으며(Fig. 4), pyruvate와 NADH를 각각 기질 및 조효소로 사용한 역반응의 경우에도 역시 효소활성을 확인할 수 있었다. 그러나 D-lactate를 기질로 반응시킨 경우에는 조효소의 존재 여부에 상관 없이 효소활성이 검출되지 않았다.
결론적으로 NAD+-의존형 L-LDH인 BcLDH1의 L-lactate 산화반응 및 pyruvate 환원반응의 비활성값(specific activity; 1분간 1 mg의 효소에 의해 전환된 lactate 또는 pyruvate의 μmole로 정의)은 각각 1.86 및 2.46 unit/mg로 측정되어, 최근 보고된 B. halodurans (17) 유래 L-LDH의 효소활성(0.3 U/mg)과 비교하여 상대적으로 높은 lactate 산화활성을 가짐을 확인하였다.
또한 NADP⁺ 또는 NADPH를 조효소로 사용한 경우에도 효소활성을 확인할 수 없었다. 이상의 결과로부터 BcLDH1 효소는 L-lactate에 특이적으로 작용하는 전형적인 NAD⁺-의존형 L-LDH 형태의 효소인 것으로 판단하였다. 특히 대부분의 LDH는 pH의 변화에 따른 효소활성의 차이가 비교적 큰 것으로 알려져 있으며(10), Huang 등(14)은 lactate에서 pyruvate로의 전환반응과 그 역반응의 최적 pH 조건이 상이한 것으로 보고한 바 있다.
특히 대부분의 LDH는 pH의 변화에 따른 효소활성의 차이가 비교적 큰 것으로 알려져 있으며(10), Huang 등(14)은 lactate에서 pyruvate로의 전환반응과 그 역반응의 최적 pH 조건이 상이한 것으로 보고한 바 있다. 따라서 서로 다른 pH 조건에서 BcLDH1의 효소활성을 비교한 결과, L-lactate 산화반응의 경우 pH 9.0에서 가장 높은 효소활성을 보인 반면, pyruvate 환원반응의 경우에는 pH 7.0이 최적인 것으로 나타났다(Fig. 5). B.
5인 것으로 보고되었다(10). BcLDH1은 특이하게 9.0의 상대적으로 높은 알칼리 pH 조건에서 최대의 lactate 산화활성을 나타내는 것을 알 수 있었으며, D-lactate를 기질로 한 경우에는 모든 pH 영역에서 활성이 검출되지 않았다. 결론적으로 NAD⁺-의존형 L-LDH인 BcLDH1의 L-lactate 산화반응 및 pyruvate 환원반응의 비활성값(specific activity; 1분간 1 mg의 효소에 의해 전환된 lactate 또는 pyruvate의 μmole로 정의)은 각각 1.
-의존형 L-LDH인 BstLDH와 60% 이상의 아미노산 서열 상동성을 보일 뿐만 아니라, 주요 활성 잔기 및 기질결합 잔기를 공유한다는 1차 구조의 분석 결과와도 일치한다. 또한 서로 다른 작용 기작에 의해 구별되는 다양한 LDH 효소의 종류 및 상동성을 서로 비교한 Table 2의 자료에 의하면, BcLDH1는 NAD⁺-의존형 D-LDH 효소군과 약 11% 내외의 매우 낮은 상동성을 나타내는 반면 L-LDH 계열의 효소들과는 50% 이상의 상대적으로 높은 상동성을 보여 효소활성 비교 결과와 일치함을 알 수 있다.
본 연구에서는 다양한 미생물 genome database의 탐색을 통해 Bacillus cereus ATCC 14579 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하고, 대장균에서 클로닝 및 대량 발현하였다. 모든 BcLDH 동질효소들의 상동부위 아미노산 잔기 대부분이 기존의 NAD⁺-의존형 LDH와 높은 상동성을 보였다. 한편 314개의 아미노산으로 이루어진 BcLDH1과 2는 86%의 서열 상동성을 보였으나, BcLDH3와는 49%의 상동성을 나타냈다.
흥미롭게도 BcLDH1만이 NAD⁺조효소 존재 하에서 L-lactate와 pyruvate 간의 상호전환 활성을 나타냈으며, 그 외의 동질효소들은 거의 활성을 보이지 않았다. 결론적으로 BcLDH1은 전형적인 NAD⁺-의존형이며, L-lactate에 특이적인 dehydrogenase 효소임을 확인하였다.
기존 연구(5, 6, 23)를 통해 제안된 활성 부위와 기질결합 부위 등을 포함하는 LDH의 상동부위 아미노산 잔기들이 대부분 BcLDH 추정 유전자 상에서도 동일한 위치에 존재함을 확인하였다. 특히 효소활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Gln85 (BcLDH3의 경우 Pro85에 해당), Asp151, Arg154, His178 잔기 외에도, 기질결합에 관여하는 Arg91, Asp180, Thr232 잔기 또한 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다. 한편 fructose-1,6- bisphosphate (FBP)와 결합하여 allosteric 조절작용에 영향을 미치는 Arg156과 His171 잔기(5, 6) 또한 이들 유전자에서 동일하게 발견되었다.

후속연구

그러나, BcLDH1과 86%에 달하는 높은 서열 상동성을 가지며, 주요 활성 부위의 아미노산 잔기를 대부분 공유하는 BcLDH2에서 LDH 활성이 전혀 검출되지 않은 것은 의외의 결과이다. 따라서 향후 이들 효소의 아미노산 서열에 대한 보다 체계적인 비교 및 단백질공학 기술을 이용한 아미노산 잔기의 상호 치환을 통해 BcLDH2의 효소활성을 증가시키는 등의 다양한 연구가 가능할 것이며, 최종적으로 L-LDH 효소의 구조와 기능의 상관관계를 규명하는 단서를 제공할 수 있을 것으로 기대한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Lactate dehydrogenases는 어떤 역할을 담당하는 효소인가?	Lactate dehydrogenases (LDHs)는 세포 내의 생화학적 대사경로에서 중요한 역할을 담당하는 효소로서 오랜 동안 많은 관심을 받았다. 본 연구에서는 다양한 미생물 genome database의 탐색을 통해 Bacillus cereus ATCC 14579 genome으로부터 LDH로 추정되는 3종의 유전자를 발견하고, 대장균에서 클로닝 및 대량 발현하였다.
	생체 내에서 lactic acid의 생합성은 무엇에 의해 수행되는가?	생체 내에서 이러한 lactic acid의 생합성은 lactate dehydrogenase (LDH)에 의해 수행되며, 이들 효소는 혐기적 조건에서 NAD(P)+/NAD(P)H와 같은 조효소의 존재 하에 해당과정(glycolysis)에 의해 생성된 pyruvate를 lactate로 전환하는 반응 또는 그 역반응을 촉매한다(4, 10). LDH 효소는 입체이성질체인 각 기질에 대한 특이성에 따라 L-lactate를 기질로 이용하는 L-LDH (EC 1.
	본 연구에서 SDS-PAGE를 이용하여, 정제된 BcLDH 동질효소의 분자량을 측정한 과정은?	정제된 BcLDH 동질효소의 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. 전기영동에는 12% separating gel과 Miniprotean II kit (Bio-Rad, USA)를 사용하였으며, Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후, 다시 destaining solution(20% methanol, 10% acetic acid)을 처리하여 단백질 band를 확인하였다. 분자량 비교를 위해 High range protein molecular weight markers (Bio-Rad)를 표준물질로 사용하였으며, 효소 단백질의 농도는 BCATM protein assay kit (Pierce Biotechnology, USA)를 이용하여 측정하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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