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문제 정의
- 612는 모두 Demospongiae에 속하는 해면으로 Hyrtios의 경우, Callyspongia와 달리 공생하는 미생물들에 의해 면역억제제, 항암제 항진균제 등 다양한 생리활성물질들을 생산하는 것으로 보고되어 있다(6, 20). 본 연구에서는 생화학적 특성이 다른 두 종의 열대 해양 해면이 동일 지역에 서식하는 경우에 있어 Hyrtios와 Callyspongia, 공생세균 군집 구조의 차이를 파악하고자 하였다.
제안 방법
- 1.5 ml tube의 100 μl선까지 분쇄된 시료를 넣고 CTAB buffer 800 μl을 첨가하여 섞은 후 동결(-70°C)과 융해(60°C)를 각각 10분씩 5회 반복 한 후, 50 μl proteinase K (10 mg/ml, Biosesang, Korea)와 50 μl lysozyme (50 mg/ml, Sigma, USA)을 첨가하여 37°C에서 2시간 처리하였다.
- 604와 Callyspongia sp. 612로부터 16S rDNA DGGE 방법을 이용하여 공생세균 군집의 다양성을 분석하였다. DGGE band로부터 염기서열 분석 결과, Hytrios sp.
- DGGE로부터 확인된 각각의 band는 적출하여 50 μl의 증류수로 DNA를 추출한 후 이것을 PCR 반응의 주형으로 GC가 제거된 341f와 518r primer 쌍을 사용하여 DGGE-PCR과 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다.
- GC clamp가 추가된 341f와 518r primer쌍을 사용하여 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, Version 2.
- PCR 반응 혼합물의 조성은 5 μl의 10× reaction buffer, 1 μl의 dNTPs, 5 unit/μl Taq polymerase (Solgent, Korea), 각각 10 pmol primer, 그리고 30 ng의 시료 DNA를 1 μl 첨가하여 최종부피가 50 μl가 되도록 하였다.
- GC clamp가 추가된 341f와 518r primer쌍을 사용하여 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, Version 2.0, USA)를 이용하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 5 μl의 10× reaction buffer, 1 μl의 dNTPs, 5 unit/μl Taq polymerase (Solgent, Korea), 각각 10 pmol primer, 그리고 30 ng의 시료 DNA를 1 μl 첨가하여 최종부피가 50 μl가 되도록 하였다.
- DGGE로부터 확인된 각각의 band는 적출하여 50 μl의 증류수로 DNA를 추출한 후 이것을 PCR 반응의 주형으로 GC가 제거된 341f와 518r primer 쌍을 사용하여 DGGE-PCR과 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 PCRpurification Kit (Solgent, Korea)를 이용하여 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다. 염기서열은 DNAstar program을 이용하여 편집하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 염기서열의 상동성을 검색하였다.
- 1). 두 해면 종의 주요 DGGE band들이 나타내는 세균 군집 다양성을 파악하기 위하여 16S rDNA의 V3 영역의 부분 염기서열을 분석하였다.
- 세균 군집의 다양성을 분석하기 위하여 DGGE band로부터 DNA를 추출하여 341f와 518r을 이용하여 재증폭하여 염기서열을 분석하였다. 적출된 DGGE band에 대하여 염기 서열을 결정한 결과, Table 1에 보는 바와 같이 Hyrtios sp.
- 여기에 70% 에탄올 500 μl를 넣어 세척하고 같은 조건으로 원심 분리하여 상등액을 제거한 후 공기 중에서 건조하고 50 μl의 증류수에 녹여 DGGE를 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
- 612에서 14개, 총 31개의 주요 band들에 대하여 부분 염기서열을 확인할 수 있었다. 이 서열들에 대하여 Blast search를 통하여 기존의 보고된 서열들과 상동성(similarity)을 검색하였다. 각각의 DGGE band에서 유래한 염기서열을 이용하여 군집구조를 분석하고(Fig.
- 1× TAE buffer를 사용하여 60°C, 30 V에서 30분간 안정화한 후 60 V로 전압을 올려 16시간 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 DGGE gel은 Ethidium bromide로 1시간 염색 후 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다.
- 0)로 전기영동 하였다. 전기영동 후 Ethidium Bromide (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다.
- 증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 2 μl를 취하여 2% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V에서 25분간 1× TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 50 mM EDTA, pH 8.0)로 전기영동 하였다.
- DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad, USA)을 이용 하여 수행하였다(12). 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide(Bio-Rad)를 포함한 10% polyacrylamide를 이용하여 35%에서 65%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다. Polyacrylamide gel은 크기 20×13 (W×H cm), 두께 1 mm로 작성하고 PCR 시료는 2× loading dye와 혼합하여 40 μl의 시료를 loading하였다.
대상 데이터
- 604와 Callyspongia sp. 612에 공생하는 세균의 다양성 조사를 위하여 2010년 2월, 남태평양에 위치한 마이크로네시아의 축 주에서 스쿠버 다이빙을 이용하여 25 m 깊이의 바다에서 채집하였다. 채집한 해면은 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후 -20°C에서 동결하여 운반하였다.
- 전기영동 후 Ethidium Bromide (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다.
- 채집한 해면은 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후 -20°C에서 동결하여 운반하였다.
이론/모형
- 612의 공생 세균의 주요 군집구조를 비배양법(culture-independent methods)에 기초한 16S rDNA-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 방법을 이용하여 비교⋅분석하였다.
- 604와 Callyspongia sp. 612의 해면 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보기 위하여 비배양 지문법인 16S rDNA의 PCR-DGGE를 수행하였다. 해면 시료로부터 추출한 gDNA를 주형으로 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭한 결과, 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다.
- DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad, USA)을 이용 하여 수행하였다(12). 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide(Bio-Rad)를 포함한 10% polyacrylamide를 이용하여 35%에서 65%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다.
- 염기서열은 DNAstar program을 이용하여 편집하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 염기서열의 상동성을 검색하였다. 계통수는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) software version 4.0의 neighbor-joining 방법을 이용하였고, 1,000회 반복 bootstrap 분석에 의해 계통수의 안정성을 조사하였다.
- 033 M bar 기압으로 14시간 건조하였다. 동결 건조된 해면은 멸균된 막자 사발에 넣고 액체질소를 부은 후 분쇄하였으며 CTAB 방법을 이용하여 total genomic DNA를 추출하였다(2). 1.
- PCR 증폭 산물은 PCRpurification Kit (Solgent, Korea)를 이용하여 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다. 염기서열은 DNAstar program을 이용하여 편집하였으며 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 염기서열의 상동성을 검색하였다. 계통수는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) software version 4.
성능/효과
- DGGE band H-1, H-2, H-4, H-6 그리고 H-14는 uncultured Chloroflexus sp. (FJ481324, FJ481329, FJ481340)와 98%에서 100%의 상동성을 나타내었으며 H-3과 H-8, 그리고 H-13은 uncultured Chloroflexi bacterium (DQ661857, AM849597, AY485299)과 96%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band H-11, H-12, H-16 그리고 H-17은 uncultured actinobacterium (GQ412829, FN556227, FN556246, AJ347072)과 98%에서 100%의 상동성을 나타내었다.
- C-10은 Halomonas sp. (HM026177)와 98%, C-11은 Vibrio comitans (DQ922918)와 98%, C-13은 Uncultured Chloroflexi (EF076104)과 98%의 상동성을 각각 나타내었다(Table 1).
- 604는 Callyspongia sp. 612에 비해 더 다양한 공생세균 군집을 나타내었으며 주요 공생세균 군집으로 Actionobacteria가 포함되었다. 동일 지역에 서식하나 화학적 특성이 다른 두 해면 종의 세균 군집은 서로 다른 것으로 나타났다.
- DGGE band C-1, C-3 C-4, C-5 C-6, C-7 C-12 그리고 C-14는 uncultured Alphaproteobacteria (FJ422778, GQ337224, FJ422768, GQ342231, FN435566, FJ800262, HM128528, HM036451, FN435363)와 각각 96% 이상의 상동성을 나타내었으며, C-2, C-8과 C-9는 uncultured cyanobacterium (GU461222, HM128528, GQ480671)과 94%에서 97%의 상동성을 나타내었다. C-10은 Halomonas sp.
- (FJ481324, FJ481329, FJ481340)와 98%에서 100%의 상동성을 나타내었으며 H-3과 H-8, 그리고 H-13은 uncultured Chloroflexi bacterium (DQ661857, AM849597, AY485299)과 96%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band H-11, H-12, H-16 그리고 H-17은 uncultured actinobacterium (GQ412829, FN556227, FN556246, AJ347072)과 98%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band H-5는 Uncultured cyanobacterium (M63813)과 94%, H-7은 Uncultured Acidobacteria (AM849603)와 95%, H-10은 Halomonas halophila (GU001901)와 96%, 그리고 H-15는 Uncultured alphaproteobacterium (FJ183985)과 96%의 상동성을 각각 나타내었다.
- DGGE band H-11, H-12, H-16 그리고 H-17은 uncultured actinobacterium (GQ412829, FN556227, FN556246, AJ347072)과 98%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band H-5는 Uncultured cyanobacterium (M63813)과 94%, H-7은 Uncultured Acidobacteria (AM849603)와 95%, H-10은 Halomonas halophila (GU001901)와 96%, 그리고 H-15는 Uncultured alphaproteobacterium (FJ183985)과 96%의 상동성을 각각 나타내었다.
- 두 해면의 DGGE band로부터 결정된 서열들은 기존의 알려진 서열들과 94%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band의 패턴은 다양하였으나, band로부터 밝혀진 대부분의 서열들은 배양되지 않은 세균 클론(uncultured bacterial clone)들과 높은 상동성을 나타내었다. 일반적으로 자연계의 미생물 중실제 배양 가능한 종은 전체 자연계 미생물 군집의 1% 이하인 것으로 알려진 바와 같이 본 연구에서 조사된 해면에 존재하는 세균 군집 역시 배양되지 않는 세균 군집이 높은 비율로 존재함을 알 수 있었다.
- 두 해면의 DGGE band로부터 결정된 서열들은 기존의 알려진 서열들과 94%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE band의 패턴은 다양하였으나, band로부터 밝혀진 대부분의 서열들은 배양되지 않은 세균 클론(uncultured bacterial clone)들과 높은 상동성을 나타내었다.
- 동일 지역에 서식하나 화학적 특성이 다른 두 해면 종의 세균 군집은 서로 다른 것으로 나타났다. 발견된 공생세균의 염기서열은 90% 이상이 uncultured clone들과 높은 상동성을 나타내었다.
- DGGE band의 패턴은 다양하였으나, band로부터 밝혀진 대부분의 서열들은 배양되지 않은 세균 클론(uncultured bacterial clone)들과 높은 상동성을 나타내었다. 일반적으로 자연계의 미생물 중실제 배양 가능한 종은 전체 자연계 미생물 군집의 1% 이하인 것으로 알려진 바와 같이 본 연구에서 조사된 해면에 존재하는 세균 군집 역시 배양되지 않는 세균 군집이 높은 비율로 존재함을 알 수 있었다.
- 한편 두 종의 해면에서 공통되는 공생세균 그룹은 Proteobacteria (Alpha-, Gamma-), Chloroflexi, Cyanobacteria로 나타났으며, 이 세균 그룹들은 16S rRNA gene의 분석에 의해 지금까지 밝혀진 해면공생세균 15개 문(phylum) 중에서 가장 전형적인 세균으로 알려져 있는(4, 12) 그룹이다. 두 해면 종은 공통적으로 위의 3문의 공생세균 그룹을 포함하고 있으나 Hyrtios sp.
- 612의 해면 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보기 위하여 비배양 지문법인 16S rDNA의 PCR-DGGE를 수행하였다. 해면 시료로부터 추출한 gDNA를 주형으로 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭한 결과, 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. 두 해면 종의 공생세균의 DGGE band 패턴 분석 결과, 해면 Hyrtios sp.
- 중국 남지나해의 Selletta tenui와 Halicondria sp. 해면의 경우 본 연구와 동일한 DGGE 방법에 의해 공생세균 다양성을 조사한 결과 Proteobacteria 하나의 세균 문만이 나타나는 것으로 보고하고 있어(9) 이 결과와 비교하여 볼 때 본 연구에 사용한 두 해면 공생세균의 군집은 매우 다양한 것으로 파악된다.
후속연구
- 본 연구에서 대상으로 한 Hyrtios 속 해면의 경우 이차대사산물의 생산자로 알려져 있어 이차대사산물을 생산하는 것으로 알려진 바 없는 Callyspongia sp. 612와의 공생세균 군집구조의 비교는 공생세균의 산업적 이용의 기초자료로 활용할 수있을 것으로 기대된다. 지금까지의 연구 결과로는 숙주 특이성 뿐만 아니라 지역적 특이성에 관한 보고들도 이루어 지고 있어(2, 12) 숙주 특이성에 관하여는 더 많은 연구 결과의 축적이 필요하며, 해면 공생세균의 다양성 및 숙주 특이성 외에 공생 세균의 전이 모델, 숙주와의 상호작용 등, 광범위한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 지금까지의 연구 결과로는 숙주 특이성 뿐만 아니라 지역적 특이성에 관한 보고들도 이루어 지고 있어(2, 12) 숙주 특이성에 관하여는 더 많은 연구 결과의 축적이 필요하며, 해면 공생세균의 다양성 및 숙주 특이성 외에 공생 세균의 전이 모델, 숙주와의 상호작용 등, 광범위한 연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 공생 세균의 다양성에 관한 연구에서 가장 많이 이용되는 16S rRNA PCR-DGGE 방법은 비교적 신속하게 해면 공생세균의 군집구조를 분석할 수 있는 효과적인 방법이나 DNA 추출 방법에 따라 우점 그룹이 달라진다는 연구 결과도 제시되어 있어(4) 연구 방법에 따른 차이를 고려하면서 해면 공생세균의 다양성 및 숙주 특이성 등의 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 612와의 공생세균 군집구조의 비교는 공생세균의 산업적 이용의 기초자료로 활용할 수있을 것으로 기대된다. 지금까지의 연구 결과로는 숙주 특이성 뿐만 아니라 지역적 특이성에 관한 보고들도 이루어 지고 있어(2, 12) 숙주 특이성에 관하여는 더 많은 연구 결과의 축적이 필요하며, 해면 공생세균의 다양성 및 숙주 특이성 외에 공생 세균의 전이 모델, 숙주와의 상호작용 등, 광범위한 연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 공생 세균의 다양성에 관한 연구에서 가장 많이 이용되는 16S rRNA PCR-DGGE 방법은 비교적 신속하게 해면 공생세균의 군집구조를 분석할 수 있는 효과적인 방법이나 DNA 추출 방법에 따라 우점 그룹이 달라진다는 연구 결과도 제시되어 있어(4) 연구 방법에 따른 차이를 고려하면서 해면 공생세균의 다양성 및 숙주 특이성 등의 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- 또한 이러한 생리활성물질들이 공생하는 미생물에 의해 생산된다는 보고도 증가하고 있다(11). 해면 공생미생물에 의해 생리활성 물질의 생산이 가능하다면 해면 종 자원의 고갈을 방지할 수 있으며 보다 안정적으로 생리 활성 물질을 생산할 수 있을 것이다. 공생 미생물의 산업적 이용을 위해서는 우선 해면 공생미생물의 군집구조의 분석과 숙주 특이성 등 공생관계의 안정성 측면에서 연구가 필요하며, 특히 해면 공생세균 군집의 다양성에 관한 연구는 해면 공생세균의 특성 및 생태적 기능의 규명, 그리고 해면 공생 세균의 산업적 응용에 있어 매우 중요하다(16).
- 한편 동일 종의 해면일지라도 온대와 열대의 지리적 분포에 따라 세균군집이 다르거나(16), 혹은 계통적 유연관계가 멀며 지리적 분포가 다른 해면에서도 유사한 세균군집을 갖는다는(7) 보고 이외에도, 공생세균에 따라 소수의 해면 종에 선택적으로 공생하거나 혹은 어떤 공생세균은 숙주 특이성이 비교적 미약하여 다양한 해면 종에 공생하는 것들도 알려져 있어(15) 숙주 특이성에 관한 근거는 아직 명확히 밝혀져 있지 않다. 해면동물과 공생하는 세균의 기원은 여과섭식 시 주변 환경으로 부터 유래한 미생물의 선택적 흡착에 의하거나 혹은 생식세포를 통한 공생세균의 수직적 전달에 의한 것으로(14) 공생세균의 숙주 특이성 혹은 숙주 특이적 공생세균의 규명은 해면의 종류 및 분포에 따른 생태학적 특성뿐 만 아니라 발생학적 측면에서도 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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