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문제 정의
- , 2001). 따라서 본 연구에서는 PCR-DGGE를 이용하여 해면 공생세균의 다양성을 파악하고자 하였다.
- 본 연구에서는 비배양법에 기초한 16S rRNA gene-DGGE 방법을 이용하여 남태평양에 위치한 미크로네시아의 축(Chuuk)주에서 채집한 해양 해면 D. metachromia 두 개체를 사용하여 공생세균의 주요 군집구조를 조사하고 동일한 지역에서 채집한 동종 이 개체에 따른 해면 공생세균 군집구조의 차이를 파악하고자 하였다.
제안 방법
- 1× TAE 완충용액을 사용하여 60℃, 30 V에서 1시간 안정화시킨 후 60 V로 전압을 올려 14시간 전기영동을 수행하였다.
- 1). D. metachromia CH607에서 15개, D. metachromia CH840에서 16개의 주요 밴드를 적출하여 세균 다양성을 파악하기 위하여 16S rRNA gene의 부분 염기서열을 분석하였다.
- DGGE 결과로 얻어진 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (Thompson et al.
- DGGE 젤 상에서 분리된 밴드 중, 각 밴드를 젤에서 잘라내어 50 µl의 DW가 담긴 1.5 ml tube에 담아 상온에 하루 동안 정치하여 DNA를 추출하였다.
- GC clamp가 추가된 341f (5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 518r (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)의 primer쌍을 이용하여 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭하였다.
- PCR 반응 혼합물의 조성은 5 µl 10× reaction buffer, 1 µl의 10 mM dNTPs, 5 unit/µl Taq polymerase (Solgent, Korea), 각각의 primer 10 pmol, 그리고 100 ng의 시료 DNA를 1 µl 첨가하여 최종부피 50 µl이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다. My CyclerTM thermal cycler (Bio-Rad, USA)를 이용하여 94℃에서 40초간 변성, 65℃ (1회 당 0.5℃ touch down)에서 40초간 냉각, 72℃에서 1분간 신장, 이 과정을 30회 반복 수행한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 증폭된 DNA의 확인을 위해 PCR 반응액 2 µl를 취하여 2% 아가로즈젤(Biopure, Canada)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V에서 25분간 1× TAE 완충용액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.
- PCR 반응 혼합물의 조성은 5 µl 10× reaction buffer, 1 µl의 10 mM dNTPs, 5 unit/µl Taq polymerase (Solgent, Korea), 각각의 primer 10 pmol, 그리고 100 ng의 시료 DNA를 1 µl 첨가하여 최종부피 50 µl이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다.
- 전기영동 후 DGGE 젤은 EtBr로 30분간 염색 후 Gel Logic 200을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 각 밴드의 단일 밴드 여부는 최초 DGGE와 동일한 조건으로 DGGE를 재 수행하여 확인하였다.
- 세균 군집의 다양성을 분석하기 위하여 DGGE 밴드로부터 DNA를 추출하여 341f와 518r을 이용하여 재 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 염기 서열을 결정한 결과 Table 1에서 보는 바와 같이 총 31개의 주요 밴드에 대하여 부분 염기서열을 확인할 수 있었으며, 동일위치의 밴드는 동일한 세균 문(phylum)으로 확인 되었다(Fig.
- 1 and Table 1). 이 서열들을 blast search를 통하여 기존의 보고된 서열들과 상동성(similarity)을 검색하였다. 두 해면의 결정된 서열들은 기존에 알려진 염기서열과 93%에서 100%의 상동성을 나타내었다.
- 5 ml tube에 담아 상온에 하루 동안 정치하여 DNA를 추출하였다. 이것을 주형으로 GC가 제거된 primer 341f와 518r을 사용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물을 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다.
- 이어 5 µl 10% SDS를 넣어 65℃에서 5분간 처리한 후 phenol:chloroform (1:1, Sigma, USA)을 넣고 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액으로부터 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA를 추출한 후 DGGE를 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
- 1× TAE 완충용액을 사용하여 60℃, 30 V에서 1시간 안정화시킨 후 60 V로 전압을 올려 14시간 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 DGGE 젤은 EtBr로 30분간 염색 후 Gel Logic 200을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 각 밴드의 단일 밴드 여부는 최초 DGGE와 동일한 조건으로 DGGE를 재 수행하여 확인하였다.
- 0)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후, EtBr (ethidium bromide, 50 ng/ml)에 10분간 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다.
- 증폭된 DNA의 확인을 위해 PCR 반응액 2 µl를 취하여 2% 아가로즈젤(Biopure, Canada)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V에서 25분간 1× TAE 완충용액(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 전기영동 하였다.
- DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad)을 이용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide (Bio-Rad)를 포함한 8% polyacrylamide를 이용하여 30%에서 70%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다. Polyacrylamide 젤은 크기 20 × 13 (W × H cm), 두께 1 mm로 작성하여 PCR 시료는 2× loading dye와 혼합하여 40 µl의 시료를 loading하였다.
- 이것을 주형으로 GC가 제거된 primer 341f와 518r을 사용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물을 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다.
- metachromia의 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보기 위하여 CH607과 CH840의 두 개체의 해면을 이용하였다. 해면 시료로부터 추출한 유전체 DNA를 주형으로 16S rRNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. 두 개체의 동종 해면에서 동일한 DGGE 밴드 패턴이 나타났으며 각각 18개의 밴드가 관찰되었다(Fig.
대상 데이터
- 남태평양 미크로네시아 축(Chuuk)주에 서식하는 해양 해면 D. metachromia의 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보기 위하여 CH607과 CH840의 두 개체의 해면을 이용하였다. 해면 시료로부터 추출한 유전체 DNA를 주형으로 16S rRNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다.
- 해면 시료로부터 추출한 유전체 DNA를 주형으로 16S rRNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. 두 개체의 동종 해면에서 동일한 DGGE 밴드 패턴이 나타났으며 각각 18개의 밴드가 관찰되었다(Fig. 1). D.
- 17")에서 스쿠버 다이빙을 이용하여 약 20-25 m 깊이의 바다에서 해면을 채집하였다. 연구에 사용한 D. metachromia 두 개체의 해면은 CH607과 CH840으로 멸균된 인공해수(ASW : artificial sea water)로 3회 세척 후 -20℃에서 동결하여 운반하였다.
- 전기영동 후, EtBr (ethidium bromide, 50 ng/ml)에 10분간 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다.
- 해양 해면 Dactylospongia metachromia의 공생세균의 다양성을 조사하기 위하여 2012년 2월 남태평양 미크로네시아 축(Chuuk) 주(07°27'41.65"N, 151°53'14.49"E; 07°27'25.49"N, 151°54'27.17")에서 스쿠버 다이빙을 이용하여 약 20-25 m 깊이의 바다에서 해면을 채집하였다.
이론/모형
- 2012년 2월 미크로네시아의 축(Chuuk)주에서 채집한 해양 해면 Dactylospongia meachromia의 공생세균의 주요 군집구조를 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 방법을 이용하여 분석하였다. D.
- DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad)을 이용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide (Bio-Rad)를 포함한 8% polyacrylamide를 이용하여 30%에서 70%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다.
- DGGE 결과로 얻어진 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (Thompson et al., 1994)를 이용하여 정렬하였고 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0을 이용하여(Tamura et al., 2007) neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)에 의해 진화거리를 계산하고 계통수를 추론하였다. 1,000회 반복 bootstrap 분석에 의해 계통수를 확인하였다.
성능/효과
- DGGE 밴드로부터 DNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 알려진 염기서열들과 93–100%의 유사도를 나타내었으며 밴드로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다. D. metachromia (CH607, CH840)의 공생세균 군집구조는 Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Cyanobacteria, Spirochaetes로 총 6문 8강으로 구성되었으며 동일한 지역에서 채집한 같은 종의 해면은 동일한 공생세균 군집구조를 나타냄을 확인하였다.
- , 2002). D. metachromia 해면과는 달리 Deltaproteobacteria, Bacteroidetes의 세균그룹을 포함하는 것으로 나타났다. 반면 D.
- D. metachromia 해면의 두 개체간의 공생세균 군집 구조(Figs. 2 and 3)의 차이를 파악한 결과, 총 6문 8강으로 강(class) 수준에서 동일한 군집구조를 나타내었으며 두 개체 모두 동일한 DGGE 밴드양상과 공생세균의 분포를 나타냄을 알 수 있었다. D.
- 2 and 3)의 차이를 파악한 결과, 총 6문 8강으로 강(class) 수준에서 동일한 군집구조를 나타내었으며 두 개체 모두 동일한 DGGE 밴드양상과 공생세균의 분포를 나타냄을 알 수 있었다. D. metachromia의 공생세균의 군집구조는 Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-) 문이 총 33.3%를 차지하여, Actinobacteria (33.3%)와 함께 우점하는 문이었다. Proteobacteria 문은 해양 환경에서 흔하게 분포하며(Imhoff, 2001; Sekiguchi et al.
- 2012년 2월 미크로네시아의 축(Chuuk)주에서 채집한 해양 해면 Dactylospongia meachromia의 공생세균의 주요 군집구조를 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 방법을 이용하여 분석하였다. D. metachromia의 두 개체 CH607과 CH840를 이용하여 DGGE 분석을 수행한 결과, 동종의 두 개체 해면에서 동일한 밴드 패턴을 나타내었다. DGGE 밴드로부터 DNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 알려진 염기서열들과 93–100%의 유사도를 나타내었으며 밴드로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다.
- DGGE 밴드 D1-11은 uncultured Alphaproteobacteria (JF824774)와 100%, D2-11는 Rhodospirillaceae bacterium (AB539976)과 98% 상동성을 각각 나타내었다. DGGE 밴드 D1-18 그리고 D2-18은 uncultured Acidobacteria (JQ809487)와 94%의 상동성을 나타내었다.
- DGGE 밴드 D1-3, D2-3 그리고 D1-6은 uncultured Spirochaetes (JN596755, JN596734)와 각각 94%와 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE 밴드 D1-5, D1-10, D2-5, D2-10 그리고 D2-12은 uncultured Betaproteobacteria (EF076241)와 93%에서 96%의 상동성을 보였으며, D1-7, D1-14, D1-15, D1-16, D2-13, D2-14, D2-15, D2-16 그리고 D2-17는 uncultured Actinobacteria (FN556253, FN556232, FN556244, JN392390)와 93에서 100% 상동성을 나타내었다. D1-8, D1-9, D2-8 그리고 D2-9은 uncultured Gammaproteobacteria (FJ949286, HQ270412)와 93에서 96% 상동성을 각각 나타내었다.
- 두 해면의 결정된 서열들은 기존에 알려진 염기서열과 93%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE 밴드 패턴은 다양하였으나, D2-11를 제외한 모든 밴드로부터 밝혀진 서열들은 배양되지 않은 세균 클론(uncultured bacterial clone)들과 높은 상동성을 나타내었다.
- DGGE 밴드로부터 DNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 알려진 염기서열들과 93–100%의 유사도를 나타내었으며 밴드로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다.
- DGGE 밴드에서 D1-1과 D2-1은 uncultured Chloroflexi (GU732290)와 99% 상동성을 나타내었고, D1-2, D1-4, D2-2 그리고 D2-4는 uncultured Cyanobacteria (HQ270357, JN098341)와 93%에서 99%의 상동성을 나타내었다. DGGE 밴드 D1-3, D2-3 그리고 D1-6은 uncultured Spirochaetes (JN596755, JN596734)와 각각 94%와 100%의 상동성을 나타내었다.
- 각각의 DGGE 밴드에서 유래한 염기서열을 이용하여 계통학적 다양성을 분석한 결과, 동 종의 두 개체 D. metachromia CH607과 CH840의 공생세균 군집구조는 동일하였으며 Alphaproteobacteria (5.6%), Betaproteobacteria (16.6%), Gammaproteobacteria (11.1%), Acidobacteria (5.6%), Actinobacteria (33.3%), Chloroflexi (5.6%), Cyanobacteria (11.1%) 그리고 Spirochaetes (11.1%)로 총 6문 8강으로 구성되었다(Fig. 2). 각각의 DGGE 밴드에서 유래한 염기서열을 이용하여 계통수를 작성한 결과는 Fig.
- metachromia 해면과 유사한 군집구조를 나타내었다(Park, 2010). 그러나 Betaproteobacteria와 Spirochaetes 문은 포함하지 않아 D. metachromia 해면의 세균 다양성이 좀 더 풍부한 것으로 나타났다. Palau 지역에 서식하는 또 다른 열대 해면 Theonella swinhoei (Lithistida 목)의 경우 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria를 포함하여(Hentschel et al.
- , 2004) 본 실험 결과와 일치하는 결과였다. 동일지역에서 채집한 D. metachromia 해면종 두 개체를 이용한 본 실험의 결과, D. metachromia 해면의 경우 6문 8강에 이르는 매우 다양한 세균그룹을 포함하며, 동종 이 개체 간의 공생세균 군집 구조는 동일한 것으로 나타나 해면 종에 따른 공생세균 군집구조는 일정함을 확인할 수 있었다.
- 이 서열들을 blast search를 통하여 기존의 보고된 서열들과 상동성(similarity)을 검색하였다. 두 해면의 결정된 서열들은 기존에 알려진 염기서열과 93%에서 100%의 상동성을 나타내었다. DGGE 밴드 패턴은 다양하였으나, D2-11를 제외한 모든 밴드로부터 밝혀진 서열들은 배양되지 않은 세균 클론(uncultured bacterial clone)들과 높은 상동성을 나타내었다.
- 3과 같다. 본 연구에서 사용된 D. metachromia 해면과 동일하게 Dictyoceratida 목에 속하며 지역적으로 축(Chuuk)에 근접한 남태평양 Palau에서 채집된, Dictyoceratida 해면 4종에 관한 공생 세균 다양성 연구에서 이들은 Cyanobacteria와 Rhodobacter를 포함한 Alphaproteobacteria 그리고 Gammaproteobacteria가 존재함을 보고하였는데(Ridley et al., 2005), D. metachromia의 공생 세균 군집은 위의 세균 강을 모두 포함하며 그 외 Betaproteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi 문을 포함하는 것으로 나타나 보다 더 다양한 세균 문을 포함함을 알 수 있었다(Fig. 3). 또한 Dictyoceratida 목에 속하며 풍부한 2차 대사산물을 생성하는 것으로 알려진, 축(Chuuk)에서 채집된 Hyrtios erectus 해면의 경우 6문 7강(Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes)의 세균군집구조를 나타내어 D.
- metachromia의 경우에는 Betaproteobacteria를 포함하는 것으로 나타났다. 서로 다른 열대 해면 종들에 있어 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Cyanobacteria와 같은 공통의 세균 문들을 포함하였으나, 해면 종에 따라 공생 세균 군집의 차이를 나타냄을 알 수 있었다.
- 세균 군집의 다양성을 분석하기 위하여 DGGE 밴드로부터 DNA를 추출하여 341f와 518r을 이용하여 재 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 염기 서열을 결정한 결과 Table 1에서 보는 바와 같이 총 31개의 주요 밴드에 대하여 부분 염기서열을 확인할 수 있었으며, 동일위치의 밴드는 동일한 세균 문(phylum)으로 확인 되었다(Fig. 1 and Table 1). 이 서열들을 blast search를 통하여 기존의 보고된 서열들과 상동성(similarity)을 검색하였다.
후속연구
- , 2003). 또한 당뇨병성 세포혈관증에 관여하는 aldose reductase인 ALR2에 대하여 억제 작용을 갖는 화합물을 생산하는 것으로 보고되어 의약적으로도 중요성을 갖는 해면으로써(De La Fuente and Manzanaro, 2003; Wang et al., 2009), 이 해면의 공생세균 다양성에 관한 연구는 차후의 응용 연구에 중요할 것으로 생각된다.
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