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제안 방법
- 15 M NaCl로 1,024배 까지 2배씩 희석 후 96-well U bottom microplate(NUNC)에 20 μl씩 넣고 2%로 현탁시킨 흰쥐의 적혈구 20 μl와 각각 반응 시켰다. 1시간 동안 실온에 방치한 후 당단백질을 가하지 않은 대조군과 비교하여 적혈구 응집반응이 일어 나지 않는 최소농도의 희석배수를 구하였으며, 2회 반복하여 실시하였다.
- 2-AB 표지 올리고당을 TSK-GEL Amide 80 컬럼(4.6*250 mm, TOSOH) 을 이용하여 형광 검출기를 연결한 HPLC를 이용하여 30℃, 유속 0.4 ml/min 조건에서 실시하였다. 이동상 A는 50 mM ammonium formate(pH 9.
- 20) 분리된 단백질의 분자량과 순도를 확인하기 위해 Laemmli법22) 에 따라 12% polyacrylamide gel을 제작후 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel electrophoresis, SDSPAGE)을 실시하였으며, 분자량 표준물질(10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kDa)은 Bio-Rad사에서 구입하여 사용하였다. 단백질 정량은 이미 농도를 알고 있는 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA, Bio-Rad)을 0.
- 당단백질에 결합된 올리고당 분석을 위하여 당단백질로부터 올리고당 부분을 효소처리로 가수분해후 분리하고 이를 2-AB 시약에 의해 형광표지를 한 후 Amide 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 크로마토그램을 실시하였다(Fig. 2). 그 결과 유지시간(retention time) 70분에서 110분 사이에 올리고당 주 피크 8개를 확인하였으며, 이는 GU 표준품에 대해 4.
- 당단백질에 결합된 올리고당의 구조를 확인하고자 문헌에 제시된 방법24)을 일부 변형하여 적용하였다. 당단백질 1 mg을 0.
- 당단백질에 공유결합된 올리고당을 제거하기 위하여 당단백질 1mg을 0.5M citrate-phosphate 완충액(pH 5.0) 40 μl에 용해 후 Glycoamidase A(Seikagaku)를 30 μl 가하여 37℃에서 18시간 반응시키고, 10 mM phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.2)에 대해 투석하였다.
- 본 연구에서는 식물 유래 단백질에 결합된 올리고당이 당단백질의 활성에 미치는 영향을 확인하고, 질량분석기와 형광검출기에 의한 HPLC 방법을 올리고당의 구조를 분석하였으며, 시료는 본 연구실에서 이미 분리, 보고하고 단당 조성을 제시한20,21) 식물 유래 당단백질인 솔비나무 유래 탄수화물 결합 단백질을 이용하였다.
- 본 연구에서는 식물유래 당단백질로 본 연구실에서 분리한 탄수화물 결합 단백질을 이용하였으며, 적혈구 응집 활성에 영향을 미치는 것으로 확인된 올리고당을 구조를 확인 한 결과 서로 구조가 다른 8 종류를 확인하였다. 즉, Xyl가 결합된 올리고당이 피크 1(6.
- 올리고당이 당단백질의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 올리고당이 제거된 단백질(deglycosylated protein)을 제조 후 올리고당이 제거되지 않은 당단백질과 비교하였다. 당단백질의 올리고당을 제거하는 것으로 보고26)된 Glycoamidase A 효소 처리하고 적혈구응집 반응을 실시한 결과, 1 mg/ml을 16배로 희석한 62.
- 이 용액 5 μl를 건고된 올리고당에 가한 뒤 65℃에서 3시간 반응시키고, 원심후 2-AB 표지 올리고당을 얻어 분석에 사용하였다.
- 형광검출시 λex=330 nm, λem=420 nm에서측정하였으며, 2-AB가 표지된 glucose homopolymer 표준품 (Sigma)과 비교하여 glucose units(GU) 값을 구하였다.
데이터처리
- 형광검출시 λex=330 nm, λem=420 nm에서측정하였으며, 2-AB가 표지된 glucose homopolymer 표준품 (Sigma)과 비교하여 glucose units(GU) 값을 구하였다.25) MALDI-TOF mass spectromer는 Bruker Ultraflex(Bruker Daltonics)를 이용하여 측정하였으며, 분석 프로그램은 FlexControl 3.0 software를 이용하였다. Reflactor voltage는 26.
이론/모형
- 5 mg/ ml 표준 농도로 하여 검량선을 작성한 후, 당단백질 용액을 microplate well에 10 μl씩 넣고, 여기에 1 : 4(v/v) 비율로 희석하여 Whatman #1 여과지로 여과한 염색시약(Bio-Rad)을 각 well에 200 μl씩 넣은 후 microplate mixer에서 혼합하였다. 37℃에서 5분 동안 반응시킨 후 595 nm에서 각 well의 흡광도를 측정하여 검량선의 Y축에 대응하는 X축의 값으로 Bradford법23)에 따라 단백질을 정량하였다.
- 당단백질의 적혈구 응집반응 활성은 이미 보고한 방법에 따라 실시하였다.20) 즉, 당단백질용액 1 mg/ml을 0.
- 식물 유래 당단백질은 본 연구자들이 보고한 방법에 준하여실시하였으며, 전기영동 결과, 30 kDa에서 문헌20)에 보고된 양상과 동일한 순도 98% 이상의 단일 밴드의 결과를 얻었으며(Fig. 1, lane 2), 정제된 당단백질에 대해 Bradford 법을 이용하여 단백질 정량을 실시하고 다음 실험에 적용하였다. 분리된 당단백질의 보고된 기능중 하나인 적혈구 응집반응을 실시한 결과, 활성이 1 mg/ml을 256배 희석한 3.
- 식물 유래 당단백질인 솔비나무 유래 탄수화물 결합 단백질은 본 연구자들이 이미 문헌에 보고한 방법에 따라 분리하였다.20) 분리된 단백질의 분자량과 순도를 확인하기 위해 Laemmli법22) 에 따라 12% polyacrylamide gel을 제작후 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel electrophoresis, SDSPAGE)을 실시하였으며, 분자량 표준물질(10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kDa)은 Bio-Rad사에서 구입하여 사용하였다.
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