[논문]3-페닐-1-이소퀴놀린아민이 신경세포에서 베타 아밀로이드 전구단백질의 대사에 미치는 영향

임재윤; 조원제

3-페닐-1-이소퀴놀린아민이 신경세포에서 베타 아밀로이드 전구단백질의 대사에 미치는 영향
Effects of 3-Phenyl-1-isoquinolinamine on the Metabolism of ${\\beta}$-Amyloid Precursor Protein in Neuroblastoma Cells 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.54 no.6, 2010년, pp.529 - 534

Abstract ▼ AI-Helper

Alzheimer's disease (AD) is characterized pathologically by the presence of intracellular neurofibrillary tangles and deposition of ${\beta}$-amyloid ($A{\beta}$) peptides, which are generated by processing of amyloid precursor protein (APP). It is urgent to develop effective therapies for the treatment of AD, since our society rapidly accelerate aging. $A{\beta}$ peptides have been believed to be neurotoxic and now are also considered to have effects on the mechanism of memory formation. Recently, we investigated that a quinoline compound from natural product reduced the secretion of $A{\beta}$ from the neuroblastoma N2a cells (NL/N cell line) overexpressing APPswe. In this study, 3-phenyl-1-isoquinolinamine, a synthetic isoquinoline compound was analyzed to determine its effects on the metabolism of APP. It inhibited the secretion of $A{\beta}$ peptides from the N2a NL/N cell line. Beta-site APP cleaving enzyme (BACE) fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay revealed that it inhibited BACE activity in a dose dependent manner. Immunoblotting study showed that it inhibited APP stabilization and expression and it slightly increased the stablization and the expression of ${\gamma}$-secreatase component from the N2a NL/N cell line. We suggest that 3-phenyl-1-isoquinolinamine inhibits APP metabolism and $A{\beta}$ generation by the means of BACE inhibitory mechanism. This is the first report that 3-phenyl-1-isoquinolinamine inhibits the secretion of $A{\beta}$ peptides from neuroblastoma cells.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

19) 본 연구에서는 합성 이소퀴놀린 알칼로이드 화합물인 3-phenyl-1-isoquinolinamine이 APP의 변이 유전자를 발현하는 신경세포주로부터 Aβ의 분비를 감소시켰으며 BACE의 활성을 저해하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.

제안 방법

1×106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 serum-free DMEM으로 교환하고 16시간이 경과한 후 DMSO에 용해시킨 3-phenyl-1-isoquinolinamine 또는 양성대조군인 β-secretase inhibitor III22)를 일정농도로 처리하였다.
5)에 넣어 혼합한 후, BACE1을 첨가하여 37ºC에서 1시간 반응시켰다. 2.5 M sodium acetate를 첨가한 후 545 nm(excitation, 12 nm bandwidth) 및 585 nm(emission, 12 nm bandwidth)에서의 형광을 Infinite F200 fluorometer(Tecan, Union city, CA)로 측정하였다.
28) 3-phenyl-1-isoquinolinamine에 의한 Aβ 분비 감소효과도 이들 효소활성의 저해가 원인일 것으로 예측되어 β-secretase의 효소활성을 측정하였으며, BACE1 FRET assay의 결과를 Fig. 3에 나타내었다.
3-phenyl-1-isoquinolinamine 5, 10, 20 µM을 효소 및 기질과 함께 반응시킨 후, BACE 활성을 측정하였다.
N2a NL/N 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA21)를 실시하였다.
Detergent lysates or conditioned media were loaded on the 7% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with rabbit anti-APP polyclonal antibody to detect APP or sAPP. PS1 NT or NCT was detectd on the 14% or 7% SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with rabbit goat anti-Presenilin 1 polyclonal antibody N-19 or goat anti-Nicastrin polyclonal antibody.
단백질 50 µg을 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, sAPP(soluble APP), PS1, NCT 등의 단백질 양상을 검출하였다.
Benzylamine은 Pd-C 촉매를 이용한 접촉환원을 통하여 primary amine으로 변환시켰다. 염산염을 생성시키기 위하여 acetone에 amine을 용해시킨 후 c-HCl을 가하였다. 1H-NMR(CDCl₃): 8.
음성 대조군인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 양을 100%로 하여 3-phenyl-1-isoquinolinamine 처리시 분비량을 백분율로 표시하였다.
3에 나타내었다. 음성 대조군인 DMSO를 처리한 시료의 효소활성을 100%로 하여 3-phenyl-1-isoquinolinamine 처리시 효소활성을 백분율로 표시하였다. 3-phenyl-1-isoquinolinamine 5, 10, 20 µM을 효소 및 기질과 함께 반응시킨 후, BACE 활성을 측정하였다.

대상 데이터

APP swedish 변이 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세 포주인 N2a NL/N 세포주를 동경대학의 Iwatsubo 교수로부터 제공받아 10% FBS(Gibco, Grand Island, NY), L-glutamic acid, penicillin/streptomycin, hygromycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagel's Medium(DMEM, Sigma, St. Louis, MO) 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
사용한 시약은 Aldrich사의 시약을 정제 없이, 용매는 Junsei 및 동양화학의 제품을 정제하여 사용하였다. Thin Layer Chromatography는 Kiesel gel 254 silica gel coated plate를, column chromatography에는 Kisel gel 60(70~230 mesh)을 사용하였으며 1H-NMR은 Bruker AC 80을 사용하였다.

데이터처리

각 실험군 간의 유의성 검정은 Student's t-test로 하였으며, P 값이 0.05, 0.01 이하를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.

이론/모형

β-secretase의 활성을 측정하기 위하여 BACE1(beta site APP cleaving enzyme) FRET assay23)를 실시하였다.
융점은 Electrothermal IA 9200을 사용하여 측정하였으며 IR은 Perkin Elmer 783 Spectrometer를 이용하여 측정하였다. Cho 등의 방법에 따라 합성하였으며 합성법은 Scheme 1에 요약하였다.²⁰⁾ 간략히 기술하면 N-methyl-o-toluamide와 benzonitrile을 축합하여 생성시킨 isoquinolin-1(2H)-one을 POCl₃로 imine chloride로 변환시킨 후 benzylamine을 K₂CO₃ 존재하에 도입하였다.
단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다.²⁴⁾ 1×10⁶ 세포를 60 mm dish에서 배양하여 12시간 후에 DMSO에 녹인 3-phenyl-1-isoquinolinamine을 처리하였다.

성능/효과

26) 실험에 사용한 N2a NL/N 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 Aβ42의 분비량이 정상세포에 비해 2배 이상 증가되어 있어 분비저해 활성을 검색하기에 용이하다.
3-phenyl-1-isoquinolinamine은 농도 의존적으로 APP의 단백질 양을 감소시켜 20 µM 처리시 음성대조군에 비해 약 20%의 단백질을 검출할 수 있었다.
⁵⁾ 치매는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매 및 파킨슨 병에 의한 퇴행성 질환, 갑상선 기능 저하증에 의한 대사성 질환, 뇌종양 또는 감염성 질환 등에 기인하는 기타 치매로 분류된다.⁶⁾ 알츠하이머형 치매환자의 뇌조직에서는 신경세포 주위에서 생성되는 senile plaque와 세포내부에서 생성되는 neurofibrillary tangle과 같은 병리학적 특징을 관찰할 수 있다.^7,8) Neurofibrillary tangle은 tau protein의 과인산화에 의하여 형성되며, senile plaque는 세포 밖으로 분비된 β-amyloid(Aβ)가 신경세포 주변에서 응집되어 형성된다.
그 결과 3-phenyl-1-isoquinolinamine 20 µM에서 음성대조군의 30.75% 활성을 나타내었으며 이는 농도 의존적으로 BACE 활성을 유의성 있게 감소시켰음을 의미한다.
상기실험 결과에서 기술한 3-phenyl-1-isoquinolinamine의 Aβ의 분비저해 활성과 비교할 경우 동일 농도인 20 µM에서 유사한 저해활성을 나타내었으며 이는 3-phenyl-1-isoquinolinamine의 Aβ의 분비 저해활성은 β-secretase를 저해함으로써 기인하는 것을 의미한다.
한편, γ-secretase의 구성분자인 PS1의 아미노 말단 단편인 PS1-N-terminal fragment(NTF)와 NCT는 3-phenyl1-isoquinolinamine 농도 의존적으로 약간 증가하는 것으로 관찰되었다.
한편, CTF 분석 결과, α-CTF의 증가가 관찰되었으며 이는 α-secretase의 활성이 증가되었음을 의미하는 것이다.

후속연구

최근 천연의 이소퀴놀린 알칼로이드인 berberine이 β-secretase 저해활성 및 항산화 활성을 갖고 있다는 보고가 있어 치매 치료 약물 개발 분야에서 많은 관심을 갖고 있다.^31,32) 본 연구자들이 보고하는 3-phenyl-1-isoquinolinamine도 치매 약물 개발을 위한 후보 물질로 응용할 수 있으며 치매의 기초 연구에 프로브(probe)로서 이용될 수 있다고 사료된다.
향후, 새로이 합성되는 APP의 경시적인 변화양상을 확인함으로써 APP의 maturation, trafficking, localization에 미치는 영향 및 γ- secretase의 활성에 대한 영향도 분석해야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알츠하이머형 치매는 어떻게 분류되나?	알츠하이머형 치매는 familial type과 sporadic type으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 sporadic type으로 나타난다.1) 발병원인은 familial type의 경우, amyloid precursor protein(APP), presenilin 1, presenilin 2 등의 변이 유전자가 알려져 있으며9) sporadic type의 경우는 노화 및 ApoE4 대립형질이 보고되었다.
	치매란 무엇인가?	1) 한편, acetylcholine esterase 저해제인 donepezil, galantamine 및 rivastigmine 등이 임상에서 사용되고 있으나 부작용이 심하고 효과적인 치료제가 없는 실정이다.2-4) 치매(dementia)는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력과 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다.5) 치매는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매 및 파킨슨 병에 의한 퇴행성 질환, 갑상선 기능 저하증에 의한 대사성 질환, 뇌종양 또는 감염성 질환 등에 기인하는 기타 치매로 분류된다.
	알츠하이머형 치매의 발병원인은 무엇인가?	알츠하이머형 치매는 familial type과 sporadic type으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 sporadic type으로 나타난다.1) 발병원인은 familial type의 경우, amyloid precursor protein(APP), presenilin 1, presenilin 2 등의 변이 유전자가 알려져 있으며9) sporadic type의 경우는 노화 및 ApoE4 대립형질이 보고되었다.10,11) Aβ의 축적에 의한 senile plaque는 familial type과 sporadic type 모두에서 공통적으로 나타나는 병리현상이다.

참고문헌 (32)

Bertram, L., Lill, C. M. and Tanzi, R. E. : The genetics of Alzheimer disease: back to the future. Neuron. 68, 270 (2010).

상세보기
Sugimoto, H. : Donepezil hydrochloride: a treatment drug for Alzheimer's disease. Chem. Rec. 1, 63 (2001).

상세보기
Zarotsky, V., Sramek, J. J., and Cutler, N. R. : Galantamine hydrobromide: an agent for Alzheimer's disease. Am. J. Health Syst. Pharm. 60, 446 (2003).

상세보기
Jann, M. W. : Rivastigmine, a new-generation cholinesterase inhibitor for the treatment of Alzheimer's disease. Pharmacotherapy 20, 1 (2000).

상세보기
Iqbal, K., Sisodia, S. S. and Winblad, B. : Alzheimer's disease: Advances in etionlogy, pathogenesis and therapeutics. John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
Morris, J. C. : Classification of dementia and Alzheimer's disease. Acta Neurol. Scand. 165, 41 (1996).
Braak, H., Braak, E. and Strothjohann, M. : Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neurosci Lett. 171, 1 (1994).

상세보기
Kang, J., Lemaire, H. G., Unterbeck, A., Salbaum, J. M., Masters, C. L., Grzeschik, K. H., Multhaup, G., Beyreuther, K. and Muller-Hill, B. : The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature 325, 733 (1987).

상세보기
Selkoe, D. J. : The cell biology of beta-amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer's disease. Trends Cell Biol. 8, 447 (1998).

상세보기
Strittmatter, W. J., Weisgraber, K. H., Huang, D. Y., Dong, L. M., Salvesen, G. S., Pericak-Vance, M., Schmechel, D., Saunders, A. M., Goldgaber, D. and Roses, A. D. : Binding of human apolipoprotein E to synthetic amyloid beta peptide isoform-specific effects and implications for late-onset Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8098 (1993).

상세보기
Corder, E. H., Saunders, A. M., Strittmatter, W. J., Schmechel, D. E., Gaskell, P. C., Small, G. W., Roses, A. D., Haines, J. L. and Pericak-Vance, M. A. : Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science 261, 921 (1993).

상세보기
Vassar, R., Bennett, B. D., Babu-Khan, S., Kahn, S., Mendiaz, E. A., Denis, P., Teplow, D. B., Ross, S., Amarante, P., Loeloff, R., Luo, Y., Fisher, S., Fuller, J., Edenson, S., Lile, J., Jarosinski, M. A., Biere, A. L., Curran, E., Burgess, T., Louis, J. C., Collins, F., Treanor, J., Rogers, G. and Citron, M. : $\beta$ -Secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science 286, 735 (1999).

상세보기
Selkoe, D. J. : Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature 399, 23 (1999).

상세보기
Yu, G., Nishimura, M., Arawaka, S., Levitan, D., Zhang, L., Tandon, A., Song, Y. Q., Rogaeva, E., Chen, F., Kawarai, T., Supala, A., Levesque, L., Yu, H., Yang, D. S., Holmes, E., Milman, P., Liang, Y., Zhang, D. M., Xu, D. H., Sato, C., Rogaev, E., Smith, M., Janus, C., Zhang, Y., Aebersold, R., Farrer, L. S., Sorbi, S., Bruni, A., Fraser, P. and St. George-Hyslop, P. : Nicastrin modulates presenilin-mediated notch/glp-1 signal transduction and ${\beta}APP $ processing. Nature 407, 48 (2000).

상세보기
Lee, S. F., Shah, S., Li, H., Yu, C., Han, W. and Yu, G. : Mammalian APH-1 interacts with presenilin and nicastrin and is required for intramembrane proteolysis of amyloid- $\beta$ precursor protein and Notch. J. Biol. Chem. 277, 45013 (2002).

상세보기
Steiner, H., Winkler, E., Edbauer, D., Prokop, S., Basset, G., Yamasaki, A., Kostka, M. and Haass, C. : PEN-2 is an integral component of the $\gamma$ -secretase complex required for coordinated expression of presenilin and nicastrin. J. Biol. Chem. 277, 39062 (2002).

상세보기
Hardy, J. and Selkoe, D. J. : The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353 (2002).

상세보기
Cai, H., Wang, Y., McCarthy, D., Wen, H., Borchelt, D. R., Price, D. L. and Wong, P. C. : BACE1 is the major -secretase for generation of A peptides by neurons. Nature Neurosci. 4, 233 (2001).

상세보기
Leem, J. Y., et al. : Effect of a quinoline compound from the oriental medicine on the metabolism of $\beta$ -amyloid precursor protein in neuroblastoma cells. (manuscript in preparation).
Cho, W. J., Min, S. Y., Le, T. N. and Kim, T. S. : Synthesis of new 3-arylisoquinolinamines: effect on topoisomerase I inhibition and cytotoxicity. Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 4451 (2003).

상세보기
Wang, R., Sweeney, D., Gandy, S. E. and Sissodia, S. S. : The profile of soluble amyloid $\beta$ protein in cultured cell media. J. Biol. Chem. 271, 31894 (1996).

상세보기
Tung, J. S., Davis, D. L., Anderson, J. P., Walker, D. E., Mamo, S., Jewett, N., Hom, R. K., Sinha, S., Thorsett, E. D. and John, V. : Design of substrate-based inhibitors of human $\beta$ -secretase. J. Med. Chem. 45, 259 (2002).

상세보기
Kinoshita, A., Fukumoto, H., Shah, T., Whelan, C. M., Irizarry, M. C. and Hyman, B. T. : Demonstration by FRET of BACE interaction with the amyloid precursor protein at the cell surface and in early endosomes. J. Cell. Sci. 116, 3339 (2003).

상세보기
Leem, J. Y., Saura, C. A., Pietrzik, C., Christianson, J., Wanamaker, C., King, L. T., Veselits, M. L., Tomita, T., Gasparini, L., Iwatsubo, T., Xu, H., Green, W. N., Koo, E. H. and Thinakaran, G. : A role for presenilin 1 in regulating the delivery of amyloid precursor protein to the cell surface. Neurobiol. Dis. 11, 64 (2002).

상세보기
Citron, M., Westaway, D., Xia, W., Carlson, G., Diehl, T., Levesque, G., Johnson-Wood, K., Lee, M., Seubert, P., Davis, A., Kholodenko, D., Motter, R., Sherrington, R., Perry, B., Yao, H., Strome, R., Lieberburg, I. Rommens, J., Kim, S., Schenk, D., Fraser, P., St George Hyslop, P. and Selkoe. D. J. : Mutant presenilins of Alzheimer's disease increase production of 42- residue amyloid $\beta$ -protein in both transfected cells and transgenic mice, Nat. Med. 3, 67 (1997).

상세보기
Kuo, Y. M., Emmerling, M. R., Vigo-Pelfrey, C., Kasunic, T. C., Kirkpatrick, J. B., Murdoch, G. H., Ball, M. J. and Roher, A. E. : Water-soluble $A{\beta}$ (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J. Biol. Chem. 271, 4077 (1996).

상세보기
Takahashi, Y., Hayashi, I., Tominari, Y., Rikimaru, K., Morohashi, Y., Kan, T., Natsugari, H., Fukuyama, T., Tomita, T. and Iwatsubo, T. : Sulindac sulfide is a noncompetitive $\gamma$ -secretase inhibitor that preferentially reduces $A{\beta}$ 42 generation. J. Biol. Chem. 278, 18664 (2003).

상세보기
Sambamurti, K., Hardy, J., Refolo L. M. and Lahiri, D. K. : Targeting APP metabolism for the treatment of Alzheimer's disease. Drug Dev. Res. 56, 211 (2002).

상세보기
Skovronsky, D. M., Moore, D. B., Milla, M. E., Doms, R. W. and Lee, V. M. : Protein kinase C-dependent $\alpha$ -secretase competes with $\beta$ -secretase for cleavage of amyloid- $\beta$ precursor protein in the trans-golgi network. J. Biol. Chem. 275, 2568 (2000).

상세보기
Nunan, J. and Small, D. H. : Regulation of APP cleavage by ${\alpha}-,\;{\beta}-\;and\;{\gamma}$ -secretases. FEBS Lett. 483, 6 (2000).

상세보기
Kulkarni, S. K. and Dhir, A. : Berberine, a plant alkaloid with therapeutic potential for central nervous system disorders. Phytother Res. 24, 317 (2010).

상세보기
Jung, H. A., Min, B. S., Yokozawa, T., Lee, J. H., Kim, Y. S. and Choi, J. S. : Anti-Alzheimer and antioxidant activities of Coptidis Rhizoma alkaloids. Biol. Pharm. Bull. 32, 1433 (2009).

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증