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문제 정의
- 또한 Li 등(2009)은 여러 한우농가에서 출하된 한우개체들에서 FASN 유전자변이가 등지방두께와 육량지수에 영향을 주는 것에 대해 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 한우 FASN 유전자가 육질향상과 육량증대에 동시에 영향을 줄 수 있는 유전인자인지를 평가하기 위해서 한우개량사업소 후대검정축의 유전자형을 분석하였고, 이를 통해 한우선발에 활용될 수 있는 FASN 유전자 반수체형을 선별하고자 하였다.
- 본 연구는 지방산합성의 완성에 관여하는 소 FASN (Fatty acid synthase) 유전자내의 g.11280G>A (Silent), g.13125T>C (Exon24- His1390Tyr)와 g.17924G>A (Exon39-Thr2158Ala) 단일염기 변이들이 한우집단 925 두를 대상으로 도체형질과의 연관성 분석, 연관불균형의 정도 및 반수체형의 분석을 위하여 수행하였다.
- 본 연구는 한우개량사업소의 당대검정우 사전 선발과 한우농가현장에서 우량암소를 선발하는데 필요한 보조수단으로 한우 FASN 유전자의 활용가능성을 평가하기 위하여 수행하였다. FASN 유전자는 지방조직 혹은 간 조직에서 지방산을 합성하는 복합효소로서, 소의 FASN (Fatty Acid Synthase) 유전자는 소고기 내의 지방산 함량에 직접적인 영향을 주는 유전자로 보고되었으며(Zhang 등 2008), 특히 한우육의 우수한 풍미에 영향을 주는 불포화지방산인 올레인산 함량에 영향을 미치는 유전인자라는 연구결과를 보고 하였다(Bhuiyan 등 2009).
제안 방법
- DNA Micro Kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 정량 분석은 spectrophotometer (Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 260 nm~280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도와 순도를 확인하였다.
- FASN (GenBank accession number AF285607)의 g.11280G>A(Exon21-Silent), g.13125T>C(Exon24-His1390Tyr)와 g.17924G>A (Exon39-Thr2158Ala) 각각의 변이들을 포함하는 영역의 증폭을 위해 Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA) 프로그램을 이용하여 3개의 primer 제작하였다(Table 2).
- FASN 유전자 g.11280G>A 변이에 대한 유전자형 분석은 primer를 이용하여 증폭한 PCR 산물에서 G 변이를 인식하는 제한효소 TaqI을 처리하여 수행하였다.
- g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A에 대한 유전자형 판정은 제한효소 2 unit를 넣어 각각의 최적반응 조건하에서 6시간 이상 반응을 통해 절단된 단편들은 2.5% MetaPhor® agarose gel (LONZA, USA)에서 90mV 전압으로 40분간의 전기영동을 통해 수행하였다(Fig. 1).
- 05 이상인 반수체형은 4개(-GCG-, -ATG-, -GTA-와 -ACG-)로 나타났다. 경제형질 측정치에 대한 4개의 반수체형별의 효과는 위의 유전자형의 효과분석과 동일한 모형을 이용하여 분석을 하였다.
- 경제형질 측정치에 대한 FASN (g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A) 변이의 유전자형 효과를 추정하기 위해 SAS 9.1 Package/PC를 이용하여 혼합효과모형(MIXED) 분석을 하였으며, 유전자형의 효과가 유의한 형질들에 대해 최소유의차 검정으로 평균간 차이에 대한 유의성을 조사하였다.
- 공시재료로부터 얻는 FASN (g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A) 유전자로부터 유전자형을 분류하여 그 빈도를 계산하였고, 집단 간의 유전적 평형상태(Hardy-Weinberg equilibrium (P-value > 0.05)를 알아보기 위하여 χ2–test로 유의성을 검증하였다.
- 또한 g.13125T>C 변이에는 T 변이를 인식하는 제한효소 RsaI을 처리하여 수행하였으며 g.17924GA 변이를 인식하는 제한효소 MscI 처리하여 결정된 유전자형을 이용하였다(Table 2).
- 063으로 매우 낮게 나타났다. 또한 나머지 3개의(-GTG-, -ATA-, -ACA-) 반수체형은 그 빈도가 0.05 보다 적어 반수체형과 형질과의 연관성분석에는 제외시켰으며, 중요한 반수체형은 4개로 선별하여 연관성분석을 실시하였다.
- 625 units를 넣어 최종 반응액 25 ul을 이용하였다. 반응조건은 최초 95℃에서 10분간 예비가열 한 후 95℃에서 30초 동안 변성시키고, 각 Primer에 대응하는 annealing 온도(Table 2)에서 30초 그리고 72℃에서 40초 합성(extension)시키는 총 40 사이클 반복 증폭하고 72℃에서 5분 마지막 합성단계(final extension)를 수행하고 DNA 증폭을 중단하였다. 증폭한 산물들은 4ul를 취하여 모두 2% agarose gel에서 100 mv 전압에서 20분간 전기영동을 통해 확인한 후 유전자형 분석을 위한 제한효소처리에 이용하였다.
- 본 연구는 한우개량사업소에서 2006년도 11월부터 2009년 5월 사이에 출하된 한우 후대검정우중 도축된 925두의 등급판정결과를 이용하였는데, 냉도체 판정 후 등심조직에서 시료를 채취하여 QIAamp® DNA Micro Kit (QIAGEN, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
- 연관불균형 유의수준(r-square>0.1, D'>0.500)에 따라 계산된 반수체형 총 7개중 그 빈도가 0.05 이상인 중요한 반수체형은 4개(-GCG- [0.378], -ATG- [0.301], -GTA- [0.191], -ACG- [0.063])를 선별하여 연관성분석을 실시하였다.
- 반응조건은 최초 95℃에서 10분간 예비가열 한 후 95℃에서 30초 동안 변성시키고, 각 Primer에 대응하는 annealing 온도(Table 2)에서 30초 그리고 72℃에서 40초 합성(extension)시키는 총 40 사이클 반복 증폭하고 72℃에서 5분 마지막 합성단계(final extension)를 수행하고 DNA 증폭을 중단하였다. 증폭한 산물들은 4ul를 취하여 모두 2% agarose gel에서 100 mv 전압에서 20분간 전기영동을 통해 확인한 후 유전자형 분석을 위한 제한효소처리에 이용하였다.
- 한우집단시료 442두의 유전자형을 이용하여 g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A 총 3개의 변이들에 대한 연관불균형 (Linkage disequilibrium) 분석을 수행하였다.
대상 데이터
- 17924G>A (Exon39-Thr2158Ala) 각각의 변이들을 포함하는 영역의 증폭을 위해 Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA) 프로그램을 이용하여 3개의 primer 제작하였다(Table 2). DNA 증폭을 위해 사용된 PCR 기계는 PTC-200 themocycler (MJ Research, Watertown MA, USA) 이용하였으며, DNA 중합효소는 h-Taq polymerase (Solgent, Korea)를 사용하였다. PCR 반응조건은 template DNA 25 ng, primer 0.
데이터처리
- : 임의오차를 나타낸다. 이 식에 의해 추정된 유전자형 최소자승 평균간에는 t 검정을 하였으며, haplotype 간 표현형 차이는 contrast를 수행하였다.
이론/모형
- FASN g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A 변이 간의 연관불균형(Linkage disequilibrium) 정도를 추정하기 위해 HaploView software package (Barrett 등 2005)을 이용하여 분석을 수행하였으며 Stephens 등(2001) method 적용하여 변이간의 D'과 r2 값을 추정하였다.
- 조사된 형질은 농림부 고시(축산물 등급판정 세부기준, 제 2004-66호)의 측정방법을 이용하여 한우 등급판정결과의 도체형질인 도체중, 등지방두께, 배장근단면적, 육량지수와 근내지방도 등 5개 항목에 대하여 실시하였다(Table 1).
성능/효과
- FASN g.11280G>A 변이의 연관성분석에 있어서는 도체중(P<0.005), 등지방두께(P<0.05) 및 육량지수(P<0.05)에 유의성이 있는 것으로 나타났는데, GG형을 가진 개체는 AA형과 AG형에 비해 도체중이 적지만 등지방두께는 얇아 육량지수는 높은 것으로 나타났다(Table 4).
- FASN g.17924G>A 변이의 연관성분석에 있어서는 도체중에 유의성이 있었는데(P<0.05), GG형을 가진 개체는 AA형과 이형접합체인 AG형에 비해 도체중은 높은 것으로 나타났다 (Table 4).
- 063])를 선별하여 연관성분석을 실시하였다. FASN 반수 체형 1번(-GCG-), 반수체형 2번(-ATG-)와 반수체형 4번 (-ACG-)는 한우집단에서 형질과의 유의적인 연관성을 관찰 할 수 없었으나 FASN 반수체형 3번(-GTA-)은 도체중과 연관성을 보였다(P=0.0327). 염색체상 반수체형 -GTA- 구조를 가지지 않은 동형접합체(0-copies)인 개체의 도체중은 354.
- 500)으로 만든 중요한 4개의 반수체형 (Haplotype)에 따른 형질과의 연관성을 나타낸다. FASN 반수체형 1번(-GCG-), 반수체형 2번(-ATG-)와 반수체형 4번(-ACG-)은 한우집단에서 도체중, 배장근단면적, 등지방두께, 근내지방도 및 육량지수에서는 연관성이 없는 것으로 나타났다. 하지만 FASN 반수체형 3번(-GTA-)은 도체중과 연관성을 보였다(P=0.
- FASN 반수체형 2번(-ATG-)은 반수체형 1번(-GCG-)과 반수체형 3번(-GTA-) 보다는 도체중이 유의적으로 높은 것으로 나타났는데(Table 5-c), 이는 FASN g.11280G>A와 g.17924G>A의 개별 유전자형 효과와 동일하였다.
- g.11280G>A 변이의 연관성분석에 있어서는 도체중, 등지방두께 및 육량지수에 유의성이 있는 것으로 관찰되었으며 g.17924G>A 변이 역시 연관성분석에서 도체중에 유의성이 있는 것으로 나타났다(P<0.05).
- 58로 최소평균값과 표준오차를 나타내었다. 그리고 반수체형 -GTA- 구조를 하나만 가지는 이형접합체(1-copies) 9두는 347.63+4.84으로 관찰되었으며 0-copies인 동형접합체보다 현저히 낮은 도체중을 나타내었다. 또한 반수체형 -GTA- 구조를 가지는 동형접합체(2-copies)인 개체는 22두가 나타났으며 도체중은 351.
- 두번째로 exon24번에 위치하는 FASN 유전자내의 g.13125T>C 변이의 빈도는 총 516두의 한우 집단에서 CC형은 98두(19%)로 관찰되었으며, CT 형은 269두(52%), 그리고 TT 형은 149두로 (29%)로 나타났고, 하디와인버그평형(P-value>0.05)에 만족 하는 것으로 나타났다(Table 3).
- 또한 g.11280G>A, g.13125T>C와 g.17924G>A 변이들에 대한 연관불균형(Linkage disequilibrium) 분석을 한 결과 g.11280G>A와 g.13125T>C 두 변이에 대한 r-square=0.177로 나타났으며 D'=0.568로 관측되었다.
- 84으로 관찰되었으며 0-copies인 동형접합체보다 현저히 낮은 도체중을 나타내었다. 또한 반수체형 -GTA- 구조를 가지는 동형접합체(2-copies)인 개체는 22두가 나타났으며 도체중은 351.01+4.1808로 0-copies 인 동형접합체 보다 낮은 도체중을 나타내었다. 이 결과는 g.
- 84으로 관찰되었으며 0-copies인 동형접합체보다 현저히 낮은 도체중을 나타내었다. 또한 반수체형 -GTA- 구조를 가지는 동형접합체(2-copies)인 개체는 22두가 나타났으며 도체중은 351.01+4.1808로 0-copies 인 동형접합체 보다 낮은 도체중을 나타내었다. 이 결과는 g.
- 마지막으로 exon39번에 위치하는 g.17924G>A 변이의 유전자형 빈도는 총 752두의 한우집단에서 AA형은 37두(5%), GG형은 489두(65%)로 가장 빈도가 높았으며, AG형은(30%)로 나타났고, 하디와인버그평형(P-value>0.05)을 만족 하는 것으로 나타났다 (Table 3).
- 반수체형(Haplotype)을 만들기 위해 연관불균형 유의수준(rsquare>0.1, D'>0.5)에 따라 계산된 반수체형은 총 7개로(-GCG-, -ATG-, -GTA-, -ACG-, -GTG-, -ATA-, -ACA-) 나타났다 (Table 5-b).
- 0327). 염색체상 반수체형 -GTA- 구조를 가지지 않은 동형접합체(0-copies) 인 개체는 총 분석된 한우집단 442두 중 411두로 나타났으며 도체중은 354.70+3.58로 최소평균값과 표준오차를 나타내었다. 그리고 반수체형 -GTA- 구조를 하나만 가지는 이형접합체(1-copies) 9두는 347.
- 0327). 염색체상 반수체형 -GTA- 구조를 가지지 않은 동형접합체(0-copies)인 개체의 도체중은 354.70+3.58로 나타났으며, 반수체형 -GTA- 구조를 하나만 가지는 이형접합체(1-copies) 347.63+4.84으로 관찰되었으며 0-copies인 동형접합체보다 현저히 낮은 도체중을 나타내었다. 또한 반수체형 -GTA- 구조를 가지는 동형접합체(2-copies)인 개체는 22두가 나타났으며 도체중은 351.
- 이 결과는 g.11280G>A 변이의 연관성분석에서 G-대립유전자와 g.17924G>A 변이의 A 대립유전자를 가진 개체는 도체중이 적게 나가는 것으로 밝혀졌다.
- 첫번째로 exon21번에 위치하는 g.11280G>A 유전자형 빈도는 총 853두에서 AA형을 가지고 있는 개체는 132두(16%)로 나타났으며 AG형은 428두(50%), GG형은 293두(34%)로 관찰되었고, 하디와인버그평형(P-value>0.05)에 만족하는 것으로 나타났다 (Table 3).
- 추정된 D'과 r2 값을 이용하여 반수체형 7개(-GCG-, -ATG-, -GTA-, -ACG-, -GTG-, -ATA-, -ACA-) 가운데, 빈도가 >0.05 이상인 반수체형은 4개(-GCG-, -ATG-, -GTA-와 -ACG-)로 나타났다.
- 05)에 만족 하는 것으로 나타났다(Table 3). 형질연관성분석에서 조사된 모든 형질에서 유전자형에 따른 영향이 없는 것으로 나타났다(Table 4).
후속연구
- 13125T>C와 g.17924G>A 변이들은 육질 뿐만 아니라 육량에도 관여하는 것으로 사료되며, FASN 유전자내의 g.11280G>A와 g.17924G>A 두 개의 단일염기변이는 한우개량사업소의 씨숫소의 유전자 마커를 통한 도움 선발(marker assisted selection, MAS)에 이용 될 수 있을 것이며 일반농가에서도 송아지 생산을 위한 암소 선발에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 현재 한우의 개량은 당대검정과 후대검정을 병행하여 보증씨수소를 선발하고 있는데, 당대 검정에서 개체의 성장능력을 평가하여 후보씨수소를 선발하고, 이 후보 씨수소들이 생산한 자손들의 성장과 도체성적을 검정하여 보증씨수소를 선발하는 이원 체제를 이용하고 있다. 그러나 개체의 성장능력을 평가하는 당대검정우를 선택할 때 육질능력을 추정할 수 있는 유전자 마커를 적용하여 선발한다면 한우개량의 속도와 정확성을 높일 수 있게 될 것이다.
- 17924G>A 변이의 A 대립유전자를 가진 개체는 도체중이 적게 나가는 것으로 밝혀졌다. 따라서 반수체형-GTA- 구조를 가지지 않은 동형접합체(0-copies)인 개체들을 선발하는 것이 육량증대에 효과가 있는 것으로 사료되어 한우농가에서 후대를 생산하기 위한 암소를 선발하는데 있어서 활용될 수 있는 유전자 검사로 이용될 수 있다.
- 한우개량사업소의 후대검정 개체의 평균 연령은 24개월인데 비해, 한우농가에서는 평균 30개월령 이상 개체를 출하하고 있다. 따라서 한우 후대검정축을 통해 발굴된 유전자마커들이 다양한 상용한우집단들에서 그 효과가 추가적으로 검증되어야 할 것이다. 또한 국내 소비자들에게 고급식품으로 인정받고 있는 한우 고기의 육질 향상과 육량 증대를 위해서는 암소개량의 중요성도 부각되고 있어 성장 형질과 육질형질이 우수한 암소선발에 이용 가능한 유전자 마커의 개발의 중요성도 증가하고 있다.
- 본 연구는 한우 소고기의 불포화지방산의 함량과 조성에 영향을 주는 FASN 유전자형에 따라 한우의 도체중과 등심단면적, 육량지수에도 유의적인 차이를 밝힌 것으로, FASN 유전자형을 한우개량 사업에서 당대검정우를 선발하는데 보조수단으로 반수체 2번을 활용하고, 한우농가에서는 암소선발에 있어서 FASN 유전자 반수체 3번을 초음파측정기록과 함께 열등한 개체를 판별하는데 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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