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문제 정의
- 본 연구에서는 가래나무 추출물의 티로시나제 (tyrosinase) 저해 활성, 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 합성 저해 효과를 측정하고, 이 추출물을 함유하는 제품의 임상시험을 실시하여 미백 화장품 소재로서의 개발 가능성이 있는지를 검토하였다.
제안 방법
- B16/BL6 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생합성 저해 효과는 Matinez-Esparza [18]의 방법을 변형시켜 측정하였다 B16/BL6 멜라노마 세포에 가래나무 추출물을 30, 100, 300 pg/mL의 농도로 각각 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성량을 측정하였다 Fig. 4에서 보는 바와 같이 전 실험농도에서 세포 독성은 거의 나타나지 않았으며, 가래나무 추출물 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 멜라닌 생성이 감소하였다. 즉, 30 pg/mL에서 15%, 100 pg/mL 에서 25%, 300 |4g/mL에서 35%의 감소율을 보여 멜라닌양이 유의적으로 감소되었다.
- B16/BL6 멜라노마 세포를 이용한 티로시나제 합성 저해 효과는 Fuller 등 [19]이 실시한 ELISA 방법을 약간 변형하여 측정하였다. B16/BL6 멜라노마 세포에 가래나무 추출물을 30, 100, 300 pg/mL 의 농도로 각각 처리하고 24시간 배양한 다음 티로시나제 합성량을 측정하였다.
- 측정하였다. B16/BL6 멜라노마 세포에 가래나무 추출물을 30, 100, 300 pg/mL 의 농도로 각각 처리하고 24시간 배양한 다음 티로시나제 합성량을 측정하였다. Fig.
- Free radical의 소거 작용은 Blois [15]가 사용한 방법을 약간 변형하여 각 시료의 DPPH radical에 대한 소거효과를 측정하였다. 0.
- 96-well plate에 B16/BL6 멜라노마 세포를 2 x 104 cells/well 농도로 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액 (5 阐mL)을 첨가하고 4시간 후 원심분리하여 상등액을 제거하고 100)jL acid-isopropanol (0.04 N HC1 in isopropanol)를 첨가한 후 푸른색의 formazan 이 용출되도록 하여 micro plate reader (USA)로 565 nm에서 흡광도를 측정하여 대조그룹과 비교하였다.
- 알려져 있다. [20], 또한 이에 따른 다양한 종류의 식물성분 및 추출물에 의한 항산화 작용이 보고되어 있다 [21, 22], 따라서 가래나무 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 xanthine/xanthine oxidase에 의해 생성되는 초산화 음이온 라디칼의 소거능을 즉정하였다. 가래나무 추출물의 xanthine oxidase에 의해 생성되는 초산화 음이온 라디칼의 소거 결과는 Fig.
- 가래나무 추출물을 2% 함유한 크림 제형에 대한 미백효과를 평가하기 위하여 피시험자 20명을 대상으로 8주 동안 인체적용 시험을 실시하였다. 피시험자에게 시험제품과 대조제품을 1일 2회씩 사용하게 하였고, 자외선 조사에 의한 인공색소 침착 후 (제품사용 0주), 색소침착 2주 후 (제품사용 2주), 4주 후 (제품사용 4주), 6주 후 (제품사용 6주) 및 8주 후 (제품사용 8주)에 각각 색차계를 사용하여 미백 효과를 평가하.
- 따라서 가래나무 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 를 이용하여 항산화 작용을 측정하였다 가래나무 추출물은 투여 농도 의존적으로 DPPH radical 소거작용을 나타냈다 (Fig. 1). 즉, 가래나무 추출물을 10, 100, 1,000 ng/mL의 농도로 처리한 경우 각각의 DPPH radical 소거능은 40%, 70%, 90%로 나타났다 양성 대조그룹으로는 항산화 작용이 우수한 것으로 알려진 vitamin C를 이용하여 가래나무 추출물의 항산화 효과와 비교하였다.
- 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 검량선에서 구하고, 실험그룹의 멜라닌 양은 대조그룹의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다. 멜라닌 양은 각 well에서 측정한 단백질 농도를 기준으로 pg/mg protein으로 표기하였다.
- 8이었다 피시험자의 등에 1,000 W xenon arc lamp가 장착된 인공 자외선 방줄기 (Oriel solar UV simulator 91294, Oriel Instrument, Stratford, CT, USA)로 1 MED에 해당하는 광량의 자외선을 1일 1회씩 총 3일간 조사하였다. 색소침착이 시작되는 마지막 자외선 조사 1주일 후부터 광조사된 시험 부위에 대조제품과 시험제품을 하루 2회씩 총 8주간 도포하였다 자외선 조사 종료 1주 (제품사용 0주), 3주 (제품사용 2주), 5주 (제품사용 4주), 7주 (제품사용 6주), 9주 (제품사용 8주후) 경과 후에 각각 색차계 (Chromameter CR-400, Konica Minolta, Tokyo, Japan)를 사용흐卜여 L*, a*, b* value 변화를 총 5회 측정하여 미백효과를 평가하였다 (L : Lightness (L = 0 yields black and L =100 indicate diffuse white), a : Green to red spectrum, b : Blue to yellow spectrum).
- 세포 내 티로시나제 저해 활성은 Matinez-Esparza [18]의 방법을 변형시켜 측정하였다. 6-well plate에 5 x 104 cells/ well로 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다.
- 세포독성은 MTT 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann [1기의 방법을 변형하여 즉정하였다. 96-well plate에 B16/BL6 멜라노마 세포를 2 x 104 cells/well 농도로 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 25 U/mL) 용액을 첨가하여 25℃에서 30분간 반응한 후 565 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 초산화 음이온 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다 洪 대조그룹으로는 BHA를 사용하였으며, 농도별로 처리하旧 초산화 음이온 라디칼을 50% 소거하는 농도 (SC50)를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.
- 양성 대조그룹으로 BHA를 이용하여 가래나무 추출물의 초산화 음이온 라디칼 소거효과를 비교하였다. 그 결과 가래나무 추출물은 투여 농도 의존적으로 초산화 음이온 라디칼 소거작용을 나타내 10, 100, 1,000 曲/mL의 농도로 처리한 경우, 각각의 초산화 음이온 라디칼 소거능은 30%, 70%, 90%로 나타났다.
- 이후 micro plate reader (ELx800, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 565 nm 에서 흡광도를 측정하였다 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 DPPH radical의 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 vitamin C를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 DPPH radical을 50% 소거하는 농도 (SC50) 를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.
- 1 mM DPPH methanol 용액에 동량의 시료를 가하여 vortex mixer로 잘 혼합한 후 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 micro plate reader (ELx800, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 565 nm 에서 흡광도를 측정하였다 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 DPPH radical의 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 vitamin C를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 DPPH radical을 50% 소거하는 농도 (SC50) 를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.
- 1). 즉, 가래나무 추출물을 10, 100, 1,000 ng/mL의 농도로 처리한 경우 각각의 DPPH radical 소거능은 40%, 70%, 90%로 나타났다 양성 대조그룹으로는 항산화 작용이 우수한 것으로 알려진 vitamin C를 이용하여 가래나무 추출물의 항산화 효과와 비교하였다. 그 결과 vitamin C는 11 μg/mL에서 가래나무 추출물은 20 袈/mL에서 각각 DPPH radical!- 50% 소거하였다.
- 티로시나제 합성량 측정은 Fuller 등 [19] 이 실시한 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 96-well plate에 1 x 104 cells/well로 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다.
- 티로시나제 활성을 측정하는 과정에서 얻은 pellet에 10% DMSO를 함유한 1 N NaOH 용액 100 pL와 증류수 200 pL 를 가하고 60℃에서 1시간 배양하여 멜라닌을 완전히 용해시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 검량선에서 구하고, 실험그룹의 멜라닌 양은 대조그룹의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다.
- 인체적용 시험을 실시하였다. 피시험자에게 시험제품과 대조제품을 1일 2회씩 사용하게 하였고, 자외선 조사에 의한 인공색소 침착 후 (제품사용 0주), 색소침착 2주 후 (제품사용 2주), 4주 후 (제품사용 4주), 6주 후 (제품사용 6주) 및 8주 후 (제품사용 8주)에 각각 색차계를 사용하여 미백 효과를 평가하.였다.
- 피시험자는 25세부터 55세의 여성을 대상으로 기능성화장품 유효성 평가 가이드라인의 피시험자 선정방법에 따라 선발하였다. 피시험자의 평균 연령은 35.5서冋었으며, 색소 침착 (1.0 minimum erythemal dose (MED))을 위한 1회 조사 광량 (mJ/cm?)은 평균 29.8이었다 피시험자의 등에 1,000 W xenon arc lamp가 장착된 인공 자외선 방줄기 (Oriel solar UV simulator 91294, Oriel Instrument, Stratford, CT, USA)로 1 MED에 해당하는 광량의 자외선을 1일 1회씩 총 3일간 조사하였다. 색소침착이 시작되는 마지막 자외선 조사 1주일 후부터 광조사된 시험 부위에 대조제품과 시험제품을 하루 2회씩 총 8주간 도포하였다 자외선 조사 종료 1주 (제품사용 0주), 3주 (제품사용 2주), 5주 (제품사용 4주), 7주 (제품사용 6주), 9주 (제품사용 8주후) 경과 후에 각각 색차계 (Chromameter CR-400, Konica Minolta, Tokyo, Japan)를 사용흐卜여 L*, a*, b* value 변화를 총 5회 측정하여 미백효과를 평가하였다 (L : Lightness (L = 0 yields black and L =100 indicate diffuse white), a : Green to red spectrum, b : Blue to yellow spectrum).
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 가래나무는 Juglans mandshurica Maximowicz의 수피로 서울 경동시장 내의 한약 건재상에서 구입하여 사용하였다 건조된 가래나무를 분쇄하여 70% 에탄올로 환류 추출하여 감압농축 및 동결건조한 후 그 분말을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였다. 세포 배양에 사용된 Eagle's minimum essential medium (EMEM), penicillin-streptomycin, phosphate buffered saline (PBS) 및 fetal bovine serum (FBS)는 Lonza사 (Basel, Switzerland) 제품을 구입하였고 3-(4, 5-dimethy-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), DMSO, 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), vitamin C, 3-f-butyl-4-hydroxy anisole (BHA), bovine serum albumin (BSA) 및 nitroblue tetrazolium (NBT)는 Sigma-Aldrich사 (St.
- 본 실험에 사용한 세포는 마우스 멜라노마 (melanoma) 세포주인 B16/BL6로서 한국세포주은행 (Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다.
- 사용하였다. 세포 배양에 사용된 Eagle's minimum essential medium (EMEM), penicillin-streptomycin, phosphate buffered saline (PBS) 및 fetal bovine serum (FBS)는 Lonza사 (Basel, Switzerland) 제품을 구입하였고 3-(4, 5-dimethy-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT), DMSO, 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), vitamin C, 3-f-butyl-4-hydroxy anisole (BHA), bovine serum albumin (BSA) 및 nitroblue tetrazolium (NBT)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, Mo, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 일급 및 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
- 평가하였다. 피시험자는 25세부터 55세의 여성을 대상으로 기능성화장품 유효성 평가 가이드라인의 피시험자 선정방법에 따라 선발하였다. 피시험자의 평균 연령은 35.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였으며, 각 군 간의 통계적 유의성 검증은 Student's /-test로 하여, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 색차계를 이용한 기기적 평가는 SPSS 12.
- 05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 색차계를 이용한 기기적 평가는 SPSS 12.0 프로그램의 paired f-test로 시험제품과 대조제품간의 유의성을 검증하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- Scavenging effects of the extracts from Juglans mandshurica on superoxide anion radicals. Superoxide anion radicals were generated by a xanthine/xanthine oxidase system and measured by NBT reduction method as described in the Materials and Methods. The results were expressed as the average of triplicate experiments with S.
-
인공색소침착 후 제품의 미백 효과 평가
가래나무 추출물을 2% 함유한 크림 제형에 대한 미백효과는 피시험자 20명을 대상으로 가래나무 추출물 무첨가 크림 제형을 대조제품으로 하여 이 중 맹검법 (double-blind test)으로 평가하였다. 피시험자는 25세부터 55세의 여성을 대상으로 기능성화장품 유효성 평가 가이드라인의 피시험자 선정방법에 따라 선발하였다.
- 초산화 음이온 라디칼의 소거작용은 Furuno 등 [16]의 방법에 따라 각 시료의 xanthine-xanthine oxidase system 에 의해 생성된 초산화 음이온 라디칼을 소거하는 효과를 측정하였다. 0.
성능/효과
- 였다. 그 결과 Fig. 6에 나타낸 바와 같이 가래나무 추출물 함유 제품을 사용한 4주 후부터 대조 제품에 비해 통계적으로 유의한 수준의 피부 미백 효과를 나타내었다 또한, 시험제품과 대조제품 모두 사용 후 특별한 피부 이상반응이 관찰되지 않았으므로 (data not shown) 본 제품은 매우 안전한 미백소재가 될 것으로 사료된다.
- 음이온 라디칼 소거효과를 비교하였다. 그 결과 가래나무 추출물은 투여 농도 의존적으로 초산화 음이온 라디칼 소거작용을 나타내 10, 100, 1,000 曲/mL의 농도로 처리한 경우, 각각의 초산화 음이온 라디칼 소거능은 30%, 70%, 90%로 나타났다. 양성 대조그룹인 BHA는 32 圈/mL에서 가래나무 추출물은 25 μg/mL에서 각각 초산화 음이온 라디칼을 50% 소거하였다.
- 따라서 가래나무 추출물은 멜라닌 생합성 과정의 upstream에 작용하는 티로시나제 단백질의 활성을 저해함으로써, downstream으로의 진행을 저지하여 B16/BL6 멜라노마 세포의 티로시나제 및 멜라닌 합성 억제 효과에 직접적으로 관여하는 것으로 사료된다.
- 그 결과 vitamin C는 11 μg/mL에서 가래나무 추출물은 20 袈/mL에서 각각 DPPH radical!- 50% 소거하였다. 본 실험에서는 가래나무 추출물의 free radical 소거효과가 단일 성분인 비타민 C에 뒤지지 않는 매우 우수한 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
- 본 연구의 결과 B16/BL6 멜라노마 세포에 가래나무 추출물을 처리하면 농도 의존적으로 티로시나제 활성, 멜라닌 및 티로시나제 합성이 모두 감소하는 것으로 나타난 것으로 보아 티로시나제가 멜라닌 합성에 관여하는 주요한 효소로작용함을 알 수 있다. 이러한 사실은 Englaro [23] 등이 보고한 연구와 일치하는 사실이다.
- 양성 대조그룹인 BHA는 32 圈/mL에서 가래나무 추출물은 25 μg/mL에서 각각 초산화 음이온 라디칼을 50% 소거하였다. 상기의 결과로 볼 때 가래나무 추출물은 양성 대조그룹인 BHA보다 우수한 초산화 음이온 라디칼 소거능을 가지는 것으로 밝혀졌다
- 4에서 보는 바와 같이 전 실험농도에서 세포 독성은 거의 나타나지 않았으며, 가래나무 추출물 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 멜라닌 생성이 감소하였다. 즉, 30 pg/mL에서 15%, 100 pg/mL 에서 25%, 300 |4g/mL에서 35%의 감소율을 보여 멜라닌양이 유의적으로 감소되었다. 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 400 pg/mL에서 40%의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때 가래나무 추출물은 알부틴 보다 더 낮은 농도에서 비슷하거나 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
- 5에서 보는 바와 같이 가래나무 추출물 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 티로시나제 합성량이 감소하였다. 즉, 30 昭/mL에서 20%, 100 pg/mL에서 40%, 300 pg/mL에서 60%의 감소율을 보여 티로시나제 합성이 유의적으로 감소되었다.
- 3). 즉, 가래나무 주줄물을 30, 100, 300 ng/mL 의 농도로 처리한 경우 티로시나제 활성 저해는 각각 15%, 30%, 40%로 나타났다. 양성 대조그룹으로 사용된 알부틴(400 昭/mL)보다 더 낮은 농도에서 비슷한 효과를 보임을 알 수 있다.
- 즉, 30 pg/mL에서 15%, 100 pg/mL 에서 25%, 300 |4g/mL에서 35%의 감소율을 보여 멜라닌양이 유의적으로 감소되었다. 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 400 pg/mL에서 40%의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때 가래나무 추출물은 알부틴 보다 더 낮은 농도에서 비슷하거나 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
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