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문제 정의
- 본 연구는 솜양지꽃(Potentilla discolor)에서 분리한 단일화합물인 FA의 항염증 작용 및 기전을 LPS로 유도된 대식세포를 사용하여 항염증 효과를 밝혔다. 이러한 COX-2, iNOS 그리고 pro-inflammatory cytokine들의 발현에는 nuclear factor kappa B (NF-κB)가 promoter부위에 결합하여 조절인자로 작용한다고 보고되었다.
- 본 연구는 처음으로 솜양지꽃 뿌리에서 분리한 FA의 LPS로 유도한 RAW 264.7 및 C57BL/6 마우스에서 분리한 복강 대식세포에서 염증 매개 물질인 NO, PGE2, IL-6와 TNF-α의 생성 저해를 통한 항염증 효과를 확인하고자 하였다.
- 1,7) 본 연구진은 여러 천연물로부터 추출물을 얻고 단일화합물을 분리하여 이들의 항염증 효과를 검색하고 그 기전을 규명하여 새로운 항염증 약물 개발을 개발 하고 있다. 지금까지 항염효과가 보고된바 없는 FA를 대식세포주 및 일차배양 대식세포에서의 실험을 통해 그 항염효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- : sense strand iNOS, 5'-ATT GGC AAC ATC AGG- TCG GCC ATC ACT-3', anti-sense strand iNOS,5'- GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA- CTC-3'; sense strand COX-2, 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3' anti-sense strand COX-2, 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'; sense strand β-actin, 5'-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA- TCC GT-3', anti-sense strand βactin, 5'-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG-3'. Amplification 후에 PCR 반응 시킨 시료를 1.5% agarose gel 에서 전기영동하고 ethidium bromide 염색과 UV 조사를 통해 확인하였다.
- 양성 대조군으로는 L-arginine과의 기질경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 L-NIL (10 µM)을 사용하였다. FA에 의한 NO의 생성 억제 효과가 iNOS의 발현과 관련성이 있는가를 확인하기 위해 Western blot과 RT-PCR로 iNOS의 단백질과 mRNA 발현을 조사했다. LPS에 의해 뚜렷하게 유도된 iNOS 단백질의 발현량이 FA를 20 µM 처리했을 때부터 유의성 있는 현저한 저해를 나타내었으며, RT-PCR을 통한 mRNA의 발현 변화의 경우에도 20 µM 처리했을 때부터 유의성 있는 현저한 저해를 보였다 (Fig.
- FA의 IL-6와 TNF-α의 형성 저해 효과 − FA가 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 pro-inflammatory cytokine의 형성을 억제하는지 알아보기 위해서 IL-6와 TNF-α의 생성을 측정하였다.
- FA의 Nitriite 생성 및 iNOS 단백질과 mRNA 발현 저해 − LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 사용해서 측정하였다.
- FA의 세포독성 − FA의 항염증 효과를 규명하기에 앞서 FA가 대식세포에 독성을 통한 염증 매개 물질 저해의 가능성을 배제하고 또한 최적 용량 범위를 설정하기 위해 MTT assay를 실시하였다.
- FA의 항염증 효과를 세포독성이 없는 범위 내에서 실험하기 위해 RAW 264.7 및 일차 배양 마우스 대식세포에서는 각각 40 µM 및 100 µM을 최고농도로 설정하고 이후 실험을 진행하였다.
- Nitrite 양의 측정 − RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다.
- PCR 반응은 95℃에서 2분간 initial denaturation 시킨 후 iNOS (95℃ 1분 denaturation, 60℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1.5분 extension), COX-2 (94℃ 1분 denaturaion, 60℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension), TNFα(95℃ 1분 denaturation, 55℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension) 그리고 IL-6 (94℃ 1분 denaturation, 56℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension)를 30회 amplification 하였다.
- PGE2, TNF-α 및 IL-6 양의 측정 - 세포배양액을 취해 각각 R&D kit의 지시에 따라 PGE2, TNF-α 및 IL-6를 정량 하였다.
- RT-PCR 시험 - Easy Blue® kits (Intron Biotechnology)를 이용하여 kit의 protocol에 따라 전체 cellular RNA를 추출하였다.
- Western blot 시험 − FA를 처리한 세포 및 대조군을 PBS로 씻어낸 후 lysis buffer인 PRO-PREP (Intron Biotechnology)으로 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다.
- cDNA에 Taq DNA polymerase 1 unit, 0.2 mM dNTP, ×10 reaction buffer 그리고 5' 와 3' primers 100 pmol을 포함한 전체 부피 20 µL의 시료를 thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA)를 이용하여 PCR 분석을 하였다.
- 각각의 시료에서 MuLV reverse transcriptase, 1mM dNTP 그리고 oligo (dT12-18) 0.5 µg/µl 를 이용하여 1 ìg 의 RNA 를 역전사 하여 cDNA를 얻었다.
- 마우스 복강 대식세포 분리 − C57BL/6 mice에서 복강대식세포를 얻기 위해서 5% thioglychollate 용액 2 ml을 복강주사하고 4일 후에 복강에 추출된 세포를 저온의 DMEM배지를 이용해서 세정하여 얻어냈다.
- 본 논문에서는 FA가 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포주 및 마우스 복강에서 분리한 일차 배양 대식세포에서 염증관련 매개물질인 NO, PGE2의 생성과 관련 단백질 및 mRNA의 발현 양상 및 염증성 cytokine을 측정함으로서 항염증 작용을 확인하였다.
대상 데이터
- (Grand Island, NY)에서 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), sulfanilamide, aprotinin, leupeptin, phenylmethylsulfonylfluride (PMSF), dithiothreitol (DTT), L-N6-(1-iminoethyl)lysine (L-NIL), NS-398, Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma Chemical Co. (CA, U.S.A.)에서 구입하였으며, COX-2와 iNOS monoclonal antibodies 및 peroxidase conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology (CA, U.S.A.)에서 구입하였다. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 그리고 β-actin oligonucleotide primers 는 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 그리고 β-actin oligonucleotide primers 는 Bioneer (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- 그리고 TNF-α, IL-6, prostaglandin E2측정을 위한 kit는 R&D systems (MN, U.S.A.)에서 구입하였다.
- 양성 대조군으로는 L-arginine과의 기질경쟁에 의하여 iNOS 저해제로 알려진 L-NIL (10 µM)을 사용하였다.
- 양성 대조군으로는 선택적인 COX-2 저해제로 알려진 NS398 (5 µM)을 사용하였다.
- 5분 extension), COX-2 (94℃ 1분 denaturaion, 60℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension), TNFα(95℃ 1분 denaturation, 55℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension) 그리고 IL-6 (94℃ 1분 denaturation, 56℃ 1분 annealing 그리고 72℃ 1분 extension)를 30회 amplification 하였다. 이번 연구에서 아래의 목록과 같은 PCR primers 가 사용되었으며 Bioneer (Seoul, Korea) 에서 구입하였다. : sense strand iNOS, 5'-ATT GGC AAC ATC AGG- TCG GCC ATC ACT-3', anti-sense strand iNOS,5'- GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA- CTC-3'; sense strand COX-2, 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3' anti-sense strand COX-2, 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'; sense strand β-actin, 5'-TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA- TCC GT-3', anti-sense strand βactin, 5'-CCT AGA AGC ATT TGC GGT GCA CGA TG-3'.
- 재료 − Dulbecco’s modified Eagle’s minimum essential medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin은 life Technologies Inc. (Grand Island, NY)에서 구입하였다.
데이터처리
- #p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. the LPS-treated group; the significances of the difference between the treated groups were evaluated using the Student’s t-test.
- 통계학적 분석 - 실험치의 값은 mean±S.D.로 나타냈으며 분석은 Student’s t-test로 그 유의성을 나타내었다.
성능/효과
- 9) 이중 NO 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거 시키는 중요한 역할을 하기도 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다.10-12)
- C57BL/6 복강에서 직접 분리하여 배양한 대식세포를 사용하여 PGE2 와 NO 생성량을 측정해 본 결과 LPS에 의해 증가된 PGE2 와 NO의 형성을 FA는 농도 의존적으로 유의성 있게 모두 억제하였으며 염증성 cytokine인 IL-6와 TNFα의 생성 역시 농도 의존적인 감소를 보였다.
- FA의 PGE2 생성 및 COX-2 단백질 및 mRNA 발현 저해효과 − LPS를 전 처리한 RAW 264.7 세포에서 PGE2의 생성량이 유의성 있게 증가하였고 FA가 농도 의존적으로 PGE2의 생성량을 감소시키는 것을 확인하였다 (Fig. 4a).
- FA의 일차 배양 복강대식세포에서의 항염효과 확인 − FA가 RAW 264.7 세포에서 뿐만 아니라 C57BL/6 mice에서 얻은 일차 배양 복강대식세포에서도 항염효과를 가지는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포와 동일한 조건에서 LPS 에 의해 생성된 NO, PGE2의 양을 측정해본 결과 FA가 NO, PGE2 생성량을 고농도인 100 µM에서 각각 77%, 43% 저해하였다 (Fig. 6a,b).
- LPS에 의해 뚜렷하게 유도된 iNOS 단백질의 발현량이 FA를 20 µM 처리했을 때부터 유의성 있는 현저한 저해를 나타내었으며, RT-PCR을 통한 mRNA의 발현 변화의 경우에도 20 µM 처리했을 때부터 유의성 있는 현저한 저해를 보였다 (Fig. 3b).
- LPS에 의해서 생성된 pro-inflammatory cytokine인 IL-6와 TNF-α의 생성을 측정해본 결과 IL-6의 경우 농도 의존적으로 생성이 감소하였고 특히 100 µM에서 43% 저해되었으며 TNF-α의 경우 역시 농도 의존적인 저해 양상을 보였고, 최고농도인 100 µM에서는 34%가 저해되었다 (Fig. 6c,d).
- PGH2로부터 PGE2를 생성하는데 관여한다고 알려진 효소인 COX-2의 단백질 발현량은 FA의 최고 농도인 20 µM에서 유의성 있는 저해를 확인 하였으며, RT-PCR 결과 20 µM에서 단백질 저해 와 유사하게 COX-2의 mRNA 발현을 유의성 있게 저해하였다 (Fig. 4b).
- 7 세포에 독성이 20% 미만 농도에 대해서 실시한 NO 생성 실험에서 LPS에 의해 증가된 NO 생성이 FA에 의해 농도 의존적으로 저해되었다. 또한 Western blot 과 RT-PCR을 통해 iNOS의 단백질 및 mRNA 수준의 발현 저해 효과를 확인해본 결과 FA에 의해 그 발현량이 저해됨을 통해 FA에 의한 NO 생성량의 저해는 iNOS에 의한 것임을 밝혔다. 또 다른 염증매개 물질인 PGE2 역시 FA에 의해 그 생성량이 저해함을 확인하였다.
- 시료의 추출 및 분리 − FA는 솜양지꽃 뿌리로부터 분리한 것을 사용하였으며1) 본 실험에 사용한 FA는 HPLC-MS로 확인한 결과 순도가 95% 이상 이였다.
후속연구
- 22-23) 본 연구진은 앞으로 염증 매개 물질의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB 및 cAMP response element (CRE), SRE (serum response element), activator protein-1 (AP-1), mitogen-activated protein kinase (MAPK) 등의 다양한 전사 조절인자들의 신호전달 양상을 연구를 함으로써 FA가 어떠한 경로를 통해 항염증 효과를 가지는지 그 기전을 밝히고 추후의 in vivo 실험을 바탕으로 향후 염증성 질환의 예방 및 치료 약물의 개발가능성을 제시하고 있다.
- 하지만 mRNA단계에서의 조절이 COX-2의 단백질 발현까지는 영향을 주지 않았는데 이는 COX-2 단백질의 활성이 저해되어 PGE2의 생성량이 감소했기 때문인 것으로 추정된다. 앞으로 COX-2 activity assay를 실시하여 COX-2의 단백질 발현량과는 별개로 COX-2의 활성과 PGE2의 생성량 간의 관계를 규명할 계획이다.
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