선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 이전의 보고한 시료들과 다른, 현재 유통·판매되는 국내 및 국외산 한방 생약재 33종을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하고, 이들의 thrombin time (TT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aPTT)을 평가하여 한방 생약재의 항혈전제 개발 가능성을 평가하였다. 그 결과 수종의 한방 생약재에서 매우 강력한 항혈전 활성을 확인하고, 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 이전의 보고한 시료들과 다른, 현재 유통·판매되는 국내 및 국외산 한방 생약재 33종을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하고, 이들의 thrombin time (TT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aPTT)을 평가하여 한방 생약재의 항혈전제 개발 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- 37℃에서 0.5 U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50 μl와 20 mM CaCl₂50 μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린과 헤파린(Sigma Co., USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다.
- 사용한 한방 생약재, 원산지, 추출 부위 및 추출 효율은 Table 1에 나타내었다. 추출물은 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 coagulation parameter인 TT, PT 및 aPTT를 측정하였으며, 항혈전 활성이 인정되는 경우, 고온 및 강산 처리 후의 안정성 및 혈장 안정성을 평가하였다. 사용된 인간혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 4℃에서 5,000× g로 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하고 냉동보관 하였으며(신선동결혈장), 필요 시 상온에서 해동하여 사용하였다.
- 사용된 인간혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 4℃에서 5,000× g로 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하고 냉동보관 하였으며(신선동결혈장), 필요 시 상온에서 해동하여 사용하였다. PT와 aPTT는MD Pacific Hemostasis (MD Pacific, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다.
- 항혈전 활성은 시료의 TT, PT및 aPTT를 측정하여 평가하였다[15,19]. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정 하여 평가하였다.
- 항혈전 활성은 시료의 TT, PT및 aPTT를 측정하여 평가하였다[15,19]. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정 하여 평가하였다. 37℃에서 0.
- 제조된 추출물의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4%)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다[22].
- 트롬빈 저해활성이 우수한 10종 추출물을 대상으로 다양한 농도에서의 트롬빈 저해능을 평가하였다(Fig. 1a). 그 결과, 계혈등과 행인 추출물은 농도의존적으로 TT 값의 증가가 나타나며 1.
- 오배자는 붉나무의 잎날개에 오배자 진드기가 기생하여 만들어진 충영으로 지혈작용 등의 각종 출혈증에 응용되고 있으며, 송 등[19]이 이미 우수한 항혈전 활성을 보고한 바 있으나, 본 연구결과는 오배자의 항혈전 효과는 트롬빈의 직접저해보다는 prothrombin 및 혈장내 응고 인자의 저해에 기인하는 것으로 추측된다. 따라서 본 연구에서는 항혈전 생약재로 계혈등, 행인, 팔각향, 계지, 오배자 및 괄루근을 2차 선별하였다.
- 한방 생약재의 실제적 이용 가능성을 조사하기 위해, 에탄올 추출물의 용혈 활성을 평가하였다(Table 3). 대조구로 사용한 triton X-100은 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 생약재들은 서울시 소재의 경동시장에서 유통되는 것을 2009년도에 구입하였으며, 대한식물도감을 통해 외부형태를 검증[10]한 후 실험에 사용하였다. 약재들은 추출에 적합하도록 절단 또는 분쇄하여 10배 부피의 에탄올을 가한 후 상온에서 3일 추출하였으며, 이를3회 반복한 후 추출액을 모아 감압 농축하여 분말로 제조하였으며, 사용 전까지 4℃에서 밀봉 보관하였다.
- 사용된 인간혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 4℃에서 5,000× g로 5분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하고 냉동보관 하였으며(신선동결혈장), 필요 시 상온에서 해동하여 사용하였다.
- PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다[22]. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%), 적혈구의 100% 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100 (0.1%)을 사용하였다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
- 국내 시중에서 유통되는 한방 생약재 33종을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하였다. 사인, 고본, 백출, 구기자, 금은화, 황백, 및 형개의 경우 원산지가 서로 다른 생약재를 사용하여 총 40종의 추출물을 조제하였으며, 이는 국내산 6종, 중국산 28종, 북한산 4종, 베트남산 2종으로, 국내에서 일반적으로 유통되는 생약재의 상당부분이 중국산임을 알 수 있었다(Table 1).
데이터처리
- , USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT 평균치의 비율로 나타내었다. PT 측정은 표준 혈장(MD Pacific Co.
- 이후 65 μl CaCl2 (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. aPTT 연장 활성은 3회 이상 반복한 aPTT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 aPTT 평균치의 비율로 나타내었다.
- 실험 결과는 SPSS 17.0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA Tukey LSD 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다.
성능/효과
- 먼저 대조구로 사용된 아스피린은 1.5 mg/ml 농도에서 용매 대조구로 사용된 DMSO처리구에 비해 약 2.6배의 증가된 TT 값을 나타내었고, 헤파린은 1.5μg/ml 농도에서 대조구의 12배 이상의 TT 값을 나타내어 우수한 항트롬빈 활성을 나타내었다.
- 국내 시중에서 유통되는 한방 생약재 33종을 대상으로 에탄올 추출물을 조제하였다. 사인, 고본, 백출, 구기자, 금은화, 황백, 및 형개의 경우 원산지가 서로 다른 생약재를 사용하여 총 40종의 추출물을 조제하였으며, 이는 국내산 6종, 중국산 28종, 북한산 4종, 베트남산 2종으로, 국내에서 일반적으로 유통되는 생약재의 상당부분이 중국산임을 알 수 있었다(Table 1). 부위별로는 종자 10종, 뿌리 부위 9종, 꽃 7종, 껍질 4종, 열매 4종, 잎 3종의 순이었다.
- 5μg/ml 농도에서 대조구의 12배 이상의 TT 값을 나타내어 우수한 항트롬빈 활성을 나타내었다. 그러나 사용한 농도에서 아스피린 및 헤파린은 PT 및 aPTT값의 변화를 거의 나타내지 않아, prothrombin의 저해나 혈장내 응고 인자의 저해가 아닌 트롬빈 저해에 의한 항혈전 활성임을 알 수 있었다. 한편 시료 농도 2.
- 그러나 사용한 농도에서 아스피린 및 헤파린은 PT 및 aPTT값의 변화를 거의 나타내지 않아, prothrombin의 저해나 혈장내 응고 인자의 저해가 아닌 트롬빈 저해에 의한 항혈전 활성임을 알 수 있었다. 한편 시료 농도 2.5 mg/ml에서 TT를 측정한 결과, 사인(중국), 고본, 팔각향, 계지, 당삼, 계혈등, 행인, 오배자, 괄루근 및 포황에서 DMSO처리구에 비해 12배 이상의 증가된 TT값을 보여 강력한 트롬빈 저해활성을 확인하였고 유근피는 2.9배의 증가된 TT값을 나타내어 우수한 트롬빈 저해 활성을 확인하였다(Table 2). 한편 PT 평가결과, 계혈등, 행인, 오배자에서 대조구보다 12배 증가된 PT 값을 얻었으며, aPTT 측정 결과, 사인(베트남산), 계혈등 및 행인에서 대조구보다 12배 증가된 aPTT 값을 얻었다.
- 9배의 증가된 TT값을 나타내어 우수한 트롬빈 저해 활성을 확인하였다(Table 2). 한편 PT 평가결과, 계혈등, 행인, 오배자에서 대조구보다 12배 증가된 PT 값을 얻었으며, aPTT 측정 결과, 사인(베트남산), 계혈등 및 행인에서 대조구보다 12배 증가된 aPTT 값을 얻었다. 특히 계혈등, 행인 및 오배자의 3종의 시료에서는 모두 대조구에 비해 12배 이상 연장된 TT, PT, aPTT 값을 나타내어 강력한 항혈전 활성을 추측할 수 있었다.
- 한편 PT 평가결과, 계혈등, 행인, 오배자에서 대조구보다 12배 증가된 PT 값을 얻었으며, aPTT 측정 결과, 사인(베트남산), 계혈등 및 행인에서 대조구보다 12배 증가된 aPTT 값을 얻었다. 특히 계혈등, 행인 및 오배자의 3종의 시료에서는 모두 대조구에 비해 12배 이상 연장된 TT, PT, aPTT 값을 나타내어 강력한 항혈전 활성을 추측할 수 있었다.
- 1a). 그 결과, 계혈등과 행인 추출물은 농도의존적으로 TT 값의 증가가 나타나며 1.0 mg/ml농도에서 대조구의 9배 정도의 TT 값을 나타낸 반면, 팔각향 및 괄루근 추출물은 0.75 mg/ml 농도까지는 약한 트롬빈 저해를 나타내다가 1.0 mg/ml 농도에서부터 강력한 항혈전 활성이 인정되었다. 한편 계지와 오배자 추출물은 1.
- 5 mg/ml 농도에서는 강력한 저해능을 나타내었다(results not shown). 따라서 아스피린 1.5 mg/ml 농도 처리시의 항혈전 효과(x 2.60)를 나타내는 생약재 추출물의 농도는 약 0.5 mg/ml 농도이며, 이 농도에서 계혈 등(x 2.97), 행인(x 2.50), 팔각향(x 1.93), 계지(x 1.53), 오배자(x 1.44), 괄루근(x 1.07)의 순서로 트롬빈 저해능이 강력하였다.
- 1c에 나타내었다. 오배자와 계혈등을 제외한 시료는 aPTT 값의 변화가 없었으며, 오배자와 계혈등 추출물은 각각0.125 mg/ml 및 1.5 mg/ml 에서 대조구에 비해 12배 연장된 aPTT 값을 나타내었다. 오배자는 붉나무의 잎날개에 오배자 진드기가 기생하여 만들어진 충영으로 지혈작용 등의 각종 출혈증에 응용되고 있으며, 송 등[19]이 이미 우수한 항혈전 활성을 보고한 바 있으나, 본 연구결과는 오배자의 항혈전 효과는 트롬빈의 직접저해보다는 prothrombin 및 혈장내 응고 인자의 저해에 기인하는 것으로 추측된다.
- 항혈전 활성의 평가 중 흥미로운 생약재는 사인이었다. 사인의 경우 베트남산은 강력한 aPTT 연장효과가 나타난 반면, 중국산은 강력한 TT 연장효과가 나타났다. 이는 생약재들의 재배 환경과 채집 시기, 사용부위 및 가공방법에 따라 유용생리활성의 차이가 있다는 보고[7,23]를 통해 이해할 수 있으나, 추후 자세한 연구가 필요한 부분이다.
- 대조구로 사용한 triton X-100은 0.1% 농도에서 인간 적혈구를 100% 용혈시켰으며, amphotericin B의 경우에는 125 μg/ml 농도에서 75.3%, 250 μg/ml 농도에서 85.3%, 500 μg/ml 농도에서 89.5% 이상의 용혈활성을 나타내었다.
- 한편 우수한 항혈전 활성으로 2차 선정된 6종의 생약재 경우에는 행인 및 괄루근 추출물 500 μg/ml 농도에서 각각 15.8% 및 75.6%의 적혈구 용혈활성이 나타나, 적혈구 용혈활성이 전혀 없는 계혈등, 팔각향, 계지, 오배자 4종을 항혈전제 개발가능 생약재로 최종 선정하였다.
- 생약재의 에탄올 추출물의 경우, 500 μg/ml 농도에서 가장 높은 용혈을 나타낸 것은 황백(북한산, 중국산), 포황, 괄루근, 토사자, 사인(베트남), 방풍, 초오 순으로서 94.42%, 93.05%, 81.79%, 75.61%, 68.73%, 63.62%, 32.01% 및 36.42%의 용혈현상을 나타내었으며, 나머지 시료의 경우 500 μg/ml 농도에서 0~22.12%의 약한 용혈이 나타나 심각한 문제를 야기하지는 않을 것으로 추측되었다.
후속연구
- 사인의 경우 베트남산은 강력한 aPTT 연장효과가 나타난 반면, 중국산은 강력한 TT 연장효과가 나타났다. 이는 생약재들의 재배 환경과 채집 시기, 사용부위 및 가공방법에 따라 유용생리활성의 차이가 있다는 보고[7,23]를 통해 이해할 수 있으나, 추후 자세한 연구가 필요한 부분이다.
- 6%의 적혈구 용혈활성이 나타나, 적혈구 용혈활성이 전혀 없는 계혈등, 팔각향, 계지, 오배자 4종을 항혈전제 개발가능 생약재로 최종 선정하였다. 본 연구결과는 이미 대량생산이 확립된 한방생약제로부터 우수한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있으며, 트롬빈 및 혈장내 응고 인자에 대한 특이 저해제 개발이 가능함을 제시한다. 현재 상기 결과를 바탕으로 선정 생약제로부터 항혈전 활성성분의 분리 및 특성 연구를 진행 중에 있으며, 대량 추출 및 기능성 식품소재로의 이용 가능성을 검토 중에 있다.
- 본 연구결과는 이미 대량생산이 확립된 한방생약제로부터 우수한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있으며, 트롬빈 및 혈장내 응고 인자에 대한 특이 저해제 개발이 가능함을 제시한다. 현재 상기 결과를 바탕으로 선정 생약제로부터 항혈전 활성성분의 분리 및 특성 연구를 진행 중에 있으며, 대량 추출 및 기능성 식품소재로의 이용 가능성을 검토 중에 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.