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문제 정의
- 이러한 치주질환의 치료법으로는 원인과 염증제거와 원인 축적요소 요소제거 등의 비외과적 시술을 시도하며 이러한 치료에도 불구하고 호전되지 않거나 지지골 조직의 파괴가 현저한 경우와 재발되었을 경우에 외과적 치주 치료를 시도하고 있다. 이러한 비외과적 및 외과적 시술과 아울러 약제나 영양제를 투여하여 치주조직의 병적 상태 개선과 파괴된 조직을 재생시키는 방법들이 연구4-6)되고 있는 과정에서 우리 주변에 천연자원으로 부터의 가능한 물질로부터 유용 활성 물질을 찿는 일환으로 본 연구를 시행하였다.
- 이에 본 연구에서는 작약 추출물이 nifedipine에 의하여 나타나는 치육증식증에 어떠한 영향을 주는가를 관찰할 목적으로 실험동물을 이용하여 nifedipine 유발 치육증식증과 함께 동반되는 epidermal growth factor(EGF), 총 단백질, 칼슘의 분비에 나타날 수 있는 효과에 대한 실험을 하여 천연물로부터 검색함으로서 천연물 신약 및 건강기능식품의 소재를 개발하고자 시도하였다.
제안 방법
- 즉 표준품과 샘플은 피펫으로 EGF의 고정항체에 의해 결합한 후. 결합되지 않은 물질을 씻어낸 후, EGF로부터 효소와 결합된 다클론항체를 첨가하였다. 결합되지 않은 항체-효소 시약을제거하기 위해 세척 후, 기질 용액을 첨가하고 EGF의 결합의 나타나는 색의 강도를 450 nm에서 측정 하였다.
- 결합되지 않은 물질을 씻어낸 후, EGF로부터 효소와 결합된 다클론항체를 첨가하였다. 결합되지 않은 항체-효소 시약을제거하기 위해 세척 후, 기질 용액을 첨가하고 EGF의 결합의 나타나는 색의 강도를 450 nm에서 측정 하였다.
- 작약은 부산의 부산진 시장 소재 한약제의 도매상에서 구입하여 사용하였고, 상지대학교 박 희준교수님께 의뢰하여 확인 하였으며 시료의 일부는 (주)천호식품(부산) 표본실에 보관하였다. 구입한 작약을 선별, 정선하여 세척하고 이를 동결 건조 한 후 분말화하여 건조분말 150 g을 증류수 2 L에 넣어 초음파 세포 파생기 내에서 3회 반복 추출 하였다. 총 추출액을 여과지(Whatman No.
- 즉 실험동물에 sodium pentobarbital(50 mg/kg) 주사 후 20분 뒤에 30 mg/kg을 한 번 더 주사하여 실험이 끝날 때 까지 마취 상태를 유지하도록 하였다. 동물을 안전하도록 테이프로 반듯이 뉘어 고정시키고, 실험을 하는 동안 호흡이 가능하도록 하였다. 양쪽 하악선에 폴리에틸렌 튜브를 삽입하였다.
- 양쪽 하악선에 폴리에틸렌 튜브를 삽입하였다. 분비물의 자극은 생리식염수에 용해시킨 pilocarpine(6 mg/kg)을 복강주사 하였다. 타액을 처음 두 방울은 버리고 미리 무게를 측정한 마이크로 튜브에 30분 동안 채취15)하여 -20℃에 보관하여 EGF, 칼슘, 단백질의 측정에 사용하였다.
- 2)로 여과한 후 80℃의 감압증발기에서 감압농축 후 동결건조하여 약 20 g의 농축액을 얻었다. 이 농축액을 매일 체중을 측정하여 예비실험을 통하여 용량을 계산한 후 생리식염수에 용해하여 3주간 각 실험군은 6마리씩 분배 하여 nifedipine(250 mg/kg, po)14) 단독 투여군 및 작약 추출물(100, 200 mg/kg)과 nifedipine 을 동시에 투여 하였다. 정상 대조군은 동량의 생리식염수를 투여하였으며, 대조약물로 doxycycline(0.
- 5H2O, 1 g Na3C6H5O7/증류수 1 L), 용액 B(20 g Na2CO3, 4 g NaOH/증류수 1 L) 및 용액 C(용액 A: 용액 B = 1:50)를 사용하였다. 일정량의 타액에 용액 C를 첨가하여 혼합 후 상온에서 5-10분간 방치한후 750 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량곡선에서 단백질량을 측정하였다.
- 잇몸은 해부용 현미경의 방법에 따라 동물을 마취하고 고정하여 붉은 정도(redness), 두께(thickness), 염증(inflammation), 삼출물(exuda)을 포함하는 치은 증식 지수를 산정하였다20).
- 이 농축액을 매일 체중을 측정하여 예비실험을 통하여 용량을 계산한 후 생리식염수에 용해하여 3주간 각 실험군은 6마리씩 분배 하여 nifedipine(250 mg/kg, po)14) 단독 투여군 및 작약 추출물(100, 200 mg/kg)과 nifedipine 을 동시에 투여 하였다. 정상 대조군은 동량의 생리식염수를 투여하였으며, 대조약물로 doxycycline(0.57 mg/kg)을 사용하였다.
- 타액 분비물의 일중변동을 줄이기 위해 오전 7시에 실시하였다. 즉 실험동물에 sodium pentobarbital(50 mg/kg) 주사 후 20분 뒤에 30 mg/kg을 한 번 더 주사하여 실험이 끝날 때 까지 마취 상태를 유지하도록 하였다. 동물을 안전하도록 테이프로 반듯이 뉘어 고정시키고, 실험을 하는 동안 호흡이 가능하도록 하였다.
- 분비물의 자극은 생리식염수에 용해시킨 pilocarpine(6 mg/kg)을 복강주사 하였다. 타액을 처음 두 방울은 버리고 미리 무게를 측정한 마이크로 튜브에 30분 동안 채취15)하여 -20℃에 보관하여 EGF, 칼슘, 단백질의 측정에 사용하였다. 타액 분비속도16)는 타액채취가 끝난 후, 오른쪽과 왼쪽의 하악선 조직을 적출하여 무게를 측정한 후 타액의 중력이 1.
대상 데이터
- 동물은 효창 science(대구)로 부터 분양 받아 본 대학 동물사에서 일정한 조건(온도 : 22±0.5℃, 습도 : 46-60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle)으로 1주 동안 고형 사료로 적응시킨 체중 180±10 g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였다.
- 5℃, 습도 : 46-60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle)으로 1주 동안 고형 사료로 적응시킨 체중 180±10 g의 Sprague-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였다. 작약은 부산의 부산진 시장 소재 한약제의 도매상에서 구입하여 사용하였고, 상지대학교 박 희준교수님께 의뢰하여 확인 하였으며 시료의 일부는 (주)천호식품(부산) 표본실에 보관하였다. 구입한 작약을 선별, 정선하여 세척하고 이를 동결 건조 한 후 분말화하여 건조분말 150 g을 증류수 2 L에 넣어 초음파 세포 파생기 내에서 3회 반복 추출 하였다.
- V)을 사용하여 측정하였다. 즉 용액 A(0.5 g CuSO4. 5H2O, 1 g Na3C6H5O7/증류수 1 L), 용액 B(20 g Na2CO3, 4 g NaOH/증류수 1 L) 및 용액 C(용액 A: 용액 B = 1:50)를 사용하였다. 일정량의 타액에 용액 C를 첨가하여 혼합 후 상온에서 5-10분간 방치한후 750 nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량곡선에서 단백질량을 측정하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- Lowry의 방법17)을 이용하여 표준품은 bovine serum albumin(Sigma, Fr. V)을 사용하여 측정하였다. 즉 용액 A(0.
성능/효과
- 한편 대조약물로 사용한 doxycycline은 세균의 리보좀 30S에 결합하며 아미노 아세틸레이트 tRNA차단하는 16S rRNA에 결합하여 균의 단백질 합성을 억제하는 광범위 테트라사이클린계 항생제39)로 혈장보다 치은열구액 내에 높은 농도로 집중되는 성질과 substantivity가 큰 점, 섬유아세포와 결합조직의 부착을 증진시키는 등의 이점이 인정되어 전신적 또는 국소적 적용으로 치주질환에 병용되어 왔으며 최근에 이의 치주염에 사용하는 기전으로 교원질분해효소의 활성을 억제하고, 교원질 합성을 증진시키며, 중성구와 파골세포의 기능을 억제하며 결합조직 및 기저막 분해에 관여하는 matrix metalloproteinase를 억제한다는 사실이 밝혀 졌다40,41). 이 실험에서 백작약 추출물을 nifedipine과 동시에 투여하였을 때 대조약물로사용한 doxycycline의 투여와 유사하게 nifedipine의 투여로 감소되던 타액의 분비 속도와 타액중의 총 단백질, 칼슘 농도 및 EGF의 농도가 증가 되었으며, 현미경하에서 nifedipine의 투여로 치은의 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물의 증가가 억제되었다.
- 이에 본 실험에서는 임상에서 항균작용 등의 연구를 토대로 작약을 대상으로 nifedipine의 장기 투여로 치은 증식증을 유도한 흰쥐에 작약 추출물을 동시에 투여함으로서 치은 증식증의 억제 효과를 관찰 하여 본 결과 nifedipine의 투여로 타액의 분비 속도 및 타액중의 칼슘농도가 억제되던 것이 작약 추출물의 동시 투여로 억제 되었다. Nitric oxide는 타액에서 생성되고 하악선에서 신경전달물질로 추정되며, NO synthase (NOS)의 특별한 활성은 생쥐의 하악선에서 검출된다29).
- 칼슘 채널 저해제(calcium channel blocker)인 nifedipine과 작약추출물을 동시에 투여하고서 nifedipine으로 유도되는 치근염의 경감에 어떠한 영향을 주는 가를 관찰하여 본 결과 실험동물로부터 타액의 배출량은 nifedipine의 단독 투여로 정상군 보다 현저히 억제되던 타액 배출량이 작약 추출물을 동시에 투여함으로서 용량의존적으로 증가되는 경향을 보였다. 한편 타액중의 총단백질량, 칼슘의량 및 EGF의 량은 nifedipine의 단독투여로서 현저히 억제되던 것이 작약 추출물의 동시 투여로 증가되었다.
- 칼슘 채널 저해제(calcium channel blocker)인 nifedipine과 작약추출물을 동시에 투여하고서 nifedipine으로 유도되는 치근염의 경감에 어떠한 영향을 주는 가를 관찰하여 본 결과 실험동물로부터 타액의 배출량은 nifedipine의 단독 투여로 정상군 보다 현저히 억제되던 타액 배출량이 작약 추출물을 동시에 투여함으로서 용량의존적으로 증가되는 경향을 보였다. 한편 타액중의 총단백질량, 칼슘의량 및 EGF의 량은 nifedipine의 단독투여로서 현저히 억제되던 것이 작약 추출물의 동시 투여로 증가되었다. 흰쥐를 마취후 현미경하에 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물 및 치은 증식 지수를 관찰한 결과 nifedipine을 투여함으로서 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물의 증가 정도가 작양추출물의 동시 투여로서 억제되는 경향을 보였으며, 치은 증식 지수는 정상군에 비하여 nifedipine의 단독 투여로 현저히 증가 되던 것이 작약 추출물을 3주간 동시에 투여함으로서 정상군에는 미치지 못하나 치은 증식 점수가 억제 되었다.
- 한편 타액중의 총단백질량, 칼슘의량 및 EGF의 량은 nifedipine의 단독투여로서 현저히 억제되던 것이 작약 추출물의 동시 투여로 증가되었다. 흰쥐를 마취후 현미경하에 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물 및 치은 증식 지수를 관찰한 결과 nifedipine을 투여함으로서 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물의 증가 정도가 작양추출물의 동시 투여로서 억제되는 경향을 보였으며, 치은 증식 지수는 정상군에 비하여 nifedipine의 단독 투여로 현저히 증가 되던 것이 작약 추출물을 3주간 동시에 투여함으로서 정상군에는 미치지 못하나 치은 증식 점수가 억제 되었다. 이상의 성적으로 보아 nifedipine의 투여로 야기되는 치은증식증의 치료에 작약을 사용할 수 있는 점을 관찰하였으며 이는 작약의 항균작용에 의한 것으로 추측되며 향후 기능성 물질의 소재로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
- Nifedipine과 작약 추출물을 투여하고서 흰쥐를 마취하고서 현미경 하에서 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물 및 치은 증식 지수를 관찰한 성적이 Table 1이다. 흰쥐에 nifedipine을 투여함으로서 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물의 증가(+, ++) 정도가 작양추출물의 동시 투여로서 억제되는 경향을 보였으며, 치은 증식 지수는 정상군(0점)에 비하여 nifedipine의 단독 투여로 현저히 증가(7점) 되던 것이 작약 추출물(100, 200 mg/kg)을 3주간 동시에 투여함으로서 정상군에는 미치지 못하나 각각 6점, 3점으로 치은증식 점수가 억제 되었다.
- 흰쥐에 nifedipine을 투여함으로서 타액의 calcium 농도가 정상군(4.5±0.26 mg/dl)에 비하여 현저히 억제(3.1±0.13 mg/dl) 되던 것이 작약 추출물(100, 200 mg/kg)을 3주간 동시투여 함으로서 정상군에는 미치지 못하나 각각 3.6±0.24, 4.0±0.18 mg/dl로 증가 되었다.
- 흰쥐에 nifedipine을 투여함으로서 타액의 총 단백질 농도가 정상군(2.5±0.21 mg/dl)에 비하여 현저히 억제(1.6±0.19 mg/dl) 되던 것이 작약 추출물(100, 200 mg/kg)을 3주간 동시투여 함으로서 정상군에는 미치지 못하나 각각 2.0±0.11, 2.2±0.13 mg/dl로 증가 되었다.
후속연구
- 이상의 결과를 추론 하여 볼때 작약을 투여함으로서 nifedipine으로 유도한 흰쥐의 치은증식증의 치료에 사용할 수 있을 것으로 앞으로 더욱 많은 연구가 이루어 져야 할 것으로 생각되어진다.
- 흰쥐를 마취후 현미경하에 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물 및 치은 증식 지수를 관찰한 결과 nifedipine을 투여함으로서 붉은 정도, 두께, 염증, 삼출물의 증가 정도가 작양추출물의 동시 투여로서 억제되는 경향을 보였으며, 치은 증식 지수는 정상군에 비하여 nifedipine의 단독 투여로 현저히 증가 되던 것이 작약 추출물을 3주간 동시에 투여함으로서 정상군에는 미치지 못하나 치은 증식 점수가 억제 되었다. 이상의 성적으로 보아 nifedipine의 투여로 야기되는 치은증식증의 치료에 작약을 사용할 수 있는 점을 관찰하였으며 이는 작약의 항균작용에 의한 것으로 추측되며 향후 기능성 물질의 소재로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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