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문제 정의
- 따라서 본 연구자는 芍藥湯이 임상에서 염증작용에 많이 사용되어 온 점에 착안하여 작약탕의 추출물이 다양한 자극원에 의해 유도된 세포내의 염증반응에 미치는 영향을 조사하기 위하여 in vitro에서 염증성 매개체들 생성을 억제하는지 조사하였다.
- COX에는 COX-1과 COX-2가 존재하는데 COX-1은 항상성을 조절하기 위한 prostaglandin 합성에 관여하고 COX-2는 염증반응 부위에서 활성화된 대식세포에 의해 염증반응을 매개하는 prostaglandin 합성에 관여한다37, 38). 본 연구에서는 LPS로 처리된 RAW 264.7 세포에서 JYT는 COX-2 protein의 발현을 농도의존적으로 억제하는 양상을 보였다.
- 결론적으로, 작약탕 물추출물(JYT)은 세포내의 전염증성 인자들을 현저하게 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 작약탕이 항염증 효과를 가진다는 것을 현대 과학적으로 증명하는 것이다. 또한, 류마티스성 관절염, 알레르기성 염증 및 만성 염증질환의 치료에도 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
제안 방법
- 2시간 동안 배양한 후에, 100 μL의 발효 작용 검출기 (바이오티닐레이트된 IL-6, IL-8, TNF-α 모노클로널 항체와 avidin-HRP가 첨가되어 1시간 동안 배양하였다.
- 1% Tween 20) 용액에서 상온에서 1시간 동안 실시하였다. ERK의 발현 양을 검토하기 위해 항체로는 anti-mouseCOX-2, iNOS (1 : 1000)를 TBS-T 용액에서 희석하여 4℃에서 하루 동안 배양시킨 후 다음날 TBS-T로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG를 1 : 2000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBS-T로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1-3분간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
- PMA+A23187로 활성화된 HMC-1 세포에서 IL-8의 생성에 관해 JYT의 억제효과를 실험하였다. 상층액은 ELISA 방법에 의해 측정하였다.
- RAW 264.7 세포에서 JYT의 NO 생성 저해정도를 관찰하기 위하여 JYT를 0.5, 1 mg/mL 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다. LPS로 유도된 RAW 264.
- 따라서 NO 생성에 대한 작약탕 물추출물의 효과를 알아보기 위해 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2−의 형태로 측정하였다.
- 면역세포인 대식세포에서 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기 위하여 설치류 대식세포주인 RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인 IL-6의 생성을 ELISA를 이용하여 실험하였다. 그 결과, LPS 자극원을 처리하였을 때 IL-6 생성이 현저히 증가하였고, JYT를 0.
- 그 후, 100 μL의 기질용해제 (tetramethylbenzidime (TMB))가 각 well에 첨가되어졌고 50 μL의 stop solution(2N H2SO4)에 의해 그 반응이 멈춰지기 전 30분간 암실에서 배양되어졌고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 이후의 절차들은 실온에서 이루어졌고, 모든 표준 규격품 및 샘플들은 세 번씩 측정하였다.
- 본 연구에서는 작약탕 물추출물이 A23187과 PMA로 유도된인간비만세포(HMC-1)세포와 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 염증매개물질의 생성과 발현의 억제를 실험하였다.
- 설치류 대식세포주인 RAW 264.7 세포로부터 염증성 사이토카인 TNF-α의 생성에 관해 JYT의 억제효과를 ELISA를 이용하여 실험하였다.
- 세포가 없는 배양액은 아질산이 0-100 μM로 나타나, 이 값을 표준으로 하여 여러 실험군의 아질산 값의 흡광도를 측정하였다.
- 세포는 24 well tissue culture plates 안에 well당 1×106 개의 세포들을 배양해 작약탕 물추출물 (0.5, 1 mg/mL)의 농도로 전처리한 후 LPS 또는 A23187(1 μM) + PMA(50 nM)로 자극하였다.
- 5%phosphoric acid solution)와 동량으로 주입한 후 10분간 실온에서 방치하였다. 아질산의 농도는 ELISA 리더기를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 세포가 없는 배양액은 아질산이 0-100 μM로 나타나, 이 값을 표준으로 하여 여러 실험군의 아질산 값의 흡광도를 측정하였다.
- 인간 비만세포주인 HMC-1 세포를 PMA와 A23187로 자극하였을 때 작약탕 물추출물(JYT)의 항염증효능과 설치류의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 LPS로 자극하였을 때 JYT의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. JYT는 PMA와 A23187로 자극한 비만세포에서 전염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, TNF-α 생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 작약탕 물추출물 (0.5, 1 mg/mL)의 농도로 전처리하고 여기에 LPS (200 ng/mL)를 각각 주입한 다음 상기 대식 세포주 RAW264.7을 24시간 배양하였다. 배양한 대식세포주의 상층액을 수집하여 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.
- 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기 위하여 HMC-1 세포들 안에서 A23187+PMA로 유도된 TNF-α의 생성에 관해 JYT의 억제효과를 실험하였다.
대상 데이터
- Anti-humanTNF-α/IL-6 /IL-8 antibodies, biotinylated anti-human TNF-α/IL-6 /IL-8 antibodies, and recombinant human TNF-α/IL-6/IL-8 는 BD PharMingen (San Diego, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Bovine serum albumin(BSA), LPS, PMA, A23187(Calcymycin; C29H37N3O6), PD98059와 3-[4, 5-dimetylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 그리고 다른 시약들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. IMDM, 우태아 혈청 (Fetal bovine serum, FBS) 및 항생제는 하이크론사 (Hyclone, USA)로부터 구입하였고, 조직배양 플레이트와 직경 100 ㎜ 페트리접시는 넌크사 (Nunc, Inc, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. IMDM, 우태아 혈청 (Fetal bovine serum, FBS) 및 항생제는 하이크론사 (Hyclone, USA)로부터 구입하였고, 조직배양 플레이트와 직경 100 ㎜ 페트리접시는 넌크사 (Nunc, Inc, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Anti-humanTNF-α/IL-6 /IL-8 antibodies, biotinylated anti-human TNF-α/IL-6 /IL-8 antibodies, and recombinant human TNF-α/IL-6/IL-8 는 BD PharMingen (San Diego, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 그리고 배양 환경은 5% CO2 와 37℃를 유지하였다. PMA, A23187은 HMC-1 세포의 자극제로 사용하였다. 또한 설치류 대식 세포주(murine macrophage cell line, RAW264.
- 芍藥湯은 작약(芍藥) 15 g 당귀(當歸) 9 g 황금(黃芩) 9 g 황련(黃連) 9 g 대황(大黃) 6 g 감초(甘草) 5 g 육계(肉桂) 5 g 빈랑(檳瑯) 5 g 목향(木香) 5 g의 조성으로 되어 있으며, 대학한약국(익산, 한국)에서 구입하였다(Table 1).
- PMA, A23187은 HMC-1 세포의 자극제로 사용하였다. 또한 설치류 대식 세포주(murine macrophage cell line, RAW264.7)는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 사용하였다(Korea Research Institute of Bioscience and BiotechnologyAmerican Tissue Culture Collection). 대식세포주는 항생제 및 항균제로서 100 U/ml의 페니실린 G과 100 U/ml의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가하고 10% 열처리 우태아 혈청(heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% CO2의 습한 대기, 37℃의 온도조건으로 배양하였다.
- 인간 비만 세포주 HMC-1 cells는 IMDM medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD)에 10% fetal bovine serum과 100 U/ml penicillin/streptomycin sulfate를 첨가하여 배양하였다. 그리고 배양 환경은 5% CO2 와 37℃를 유지하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치± 표준오차 (SEM)를 구하여 신뢰수준 99%(p < 0.01)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- Effect of JYT on cell viability in HMC-1 cells. Cell viability was evaluated with the MTT assay. Data represent the means± S.
- JYT의 COX-2 protein발현에 대한 효과를 알아보기 위해 Western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 자극에 의해 활성화된 COX-2 protein 발현이 JYT 0.
- Pro-inflammatory cytokine인 IL-6의 생성을 ELISA를 이용하여 실험하였다. PMA+A23187로 활성화된 HMC-1 세포에서 IL-6의 생성량이 현저히 증가하였고, JYT를 0.
- NO는 iNOS에 의해 생성되어 炎症상태에서 혈관 투과성, 부종 등의 炎症반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 炎症매개체의 생합성을 촉진하여 炎症을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 NO를 생성하게 하는 iNOS의 protein 발현을 알아 보기위해 Western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 형성되는iNOS protein 발현은 JYT 1 mg/mL에서 현저하게 억제하였다(Fig.
- PMA+A23187로 활성화된 HMC-1 세포에서 IL-8의 생성에 관해 JYT의 억제효과를 실험하였다. 상층액은 ELISA 방법에 의해 측정하였다. JYT가 LPS로 유도된 IL-8의 생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기 위하여 HMC-1 세포들 안에서 A23187+PMA로 유도된 TNF-α의 생성에 관해 JYT의 억제효과를 실험하였다. 상층액은 ELISA 방법으로 측정하였다. JYT가 A23187+PMA로 유도된 TNF-α의 생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 세포 생존력은 MTT assay를 이용하였다. 작약탕을 처리한 세포에 10 μL의 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 5 mg/mL) 용해액을 첨가한 후 37℃에서 4시간 보존한다.
- 작약탕 물추출물(JYT)이 세포독성에 영향을 주는지 알아보기 위해 MTT 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. JYT를 0.
성능/효과
- JYT가 LPS로 유도된 IL-8의 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. JYT는 1 mg/mL에서 IL-8 생성을 74% 억제하였고, 0.5 mg/mL에서 IL-8 생성을 35% 억제하였다(Fig. 3).
- JYT는 PMA와 A23187로 자극한 비만세포에서 전염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, TNF-α 생성을 농도 의존적으로 억제하였다.
- 5, 1 mg/mL 농도로 세포에 처리하여 생성되는 NO의 양을 측정하였다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 JYT를 처리한 결과 NO 생성이 농도의존적으로 크게 억제되었다.
- Pro-inflammatory cytokine인 IL-6의 생성을 ELISA를 이용하여 실험하였다. PMA+A23187로 활성화된 HMC-1 세포에서 IL-6의 생성량이 현저히 증가하였고, JYT를 0.5, 1 mg/mL 농도로 처리하였을 때 IL-6 생성 역시 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 2).
- 결론적으로, 작약탕 물추출물(JYT)은 세포내의 전염증성 인자들을 현저하게 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 작약탕이 항염증 효과를 가진다는 것을 현대 과학적으로 증명하는 것이다.
- 그 결과, JYT가 LPS로 유도된 TNF-α의 생성을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 7).
- JYT의 COX-2 protein발현에 대한 효과를 알아보기 위해 Western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 자극에 의해 활성화된 COX-2 protein 발현이 JYT 0.5, 1 mg/mL에서 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 9).
- 7 세포로부터 염증성 사이토카인 IL-6의 생성을 ELISA를 이용하여 실험하였다. 그 결과, LPS 자극원을 처리하였을 때 IL-6 생성이 현저히 증가하였고, JYT를 0.5, 1 mg/mL의 농도를 처리하였을 때 IL-6 생성 억제 효과가 나타났다(Fig. 6).
- 따라서 NO를 생성하게 하는 iNOS의 protein 발현을 알아 보기위해 Western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 형성되는iNOS protein 발현은 JYT 1 mg/mL에서 현저하게 억제하였다(Fig. 8).
- 비만세포와 대식세포에서 작약탕 물추출물(JYT)의 염증매개 물질 발현 억제를 살펴본 결과 A23187과 PMA로 유도된 HMC-1세포에서 염증성 사이토카인 (IL-6, IL-8, TNF-α)의 발현이 JYT에의해 억제되었다 또한 JYT로 전처리 후 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서는 IL-6와 TNF-α 발현이 현저하게 줄어들었으며, 용량 의존적으로 억제되는 양상을 보였다.
- 이에 따라 NO를 생성하게 하는 iNOS의 protein의 발현을 알아보기 위하여 Western blot을 수행한 결과 LPS 처리에 의해 형성되는 iNOS protein 발현은 JYT 1 mg/mL에서 현저하게 억제함을 알 수 있었다.
- 이와 같은 결과로 보아 작약탕 물추출물(JYT)은 비만세포에 작용하여 TNF-α, IL-6, IL-8의 생성을 억제하였고, 대식세포에 작용하여 NO, TNF-α, IL-6의 생성과 iNOS, COX-2 발현을 억제함으로써 비만세포와 대식세포를 매개로 한 염증반응에 항염증효과가 있음을 알 수 있다.
- Figure 5 에서 나타낸 바와 같이 JYT를 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 NO 생성을 크게 억제하였다. 특히, JYT 1 mg/mL의 농도에서 NO 생성이 유의하게 억제되었다(Fig. 5).
후속연구
- 이상의 결과는 작약탕이 항염증 효과를 가진다는 것을 현대 과학적으로 증명하는 것이다. 또한, 류마티스성 관절염, 알레르기성 염증 및 만성 염증질환의 치료에도 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
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