[논문]소합향(蘇合香)이 신경 세포에서 베타 아밀로이드 분비에 미치는 영향

임재윤

소합향(蘇合香)이 신경 세포에서 베타 아밀로이드 분비에 미치는 영향
Effects of Styrax Liquides on the Secretion of ${\\beta}$-amyloid Precursor Protein in Neuroblastoma Cells 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.24 no.1, 2010년, pp.91 - 95

Abstract ▼ AI-Helper

Alzheimer's disease (AD) is characterized pathologically by the presence of intracellular neurofibrillary tangles and deposition of ${\beta}$-amyloid (A${\beta}$) peptides. It is urgent to develop effective therapies for the treatment of AD, since our society rapidly accelerate aging. A${\beta}$ peptides have been believed to be neurotoxic and now are also considered to have affects on the mechanism of memory formation, which are generated by processing of amyloid precursor protein (APP). In this study, effects of Styrax Liquides (SL) on the metabolism of APP were analyzed. SL inhibited the secretion of A${\beta}$ from the Neuro2a cell line (APPswe cell) expressing a mutation of APPswe. Immunoblotting study showed that it inhibited ${\beta}$-site APP cleaving enzyme (BACE) from the APPswe cells. We suggest that SL inhibits APP metabolism and A${\beta}$ generation by the means of BACE inhibitory mechanism. This is the first report that SL inhibits the secretion of A${\beta}$ peptides from neuroblastoma cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 蘇合香이 APP의 변이 유전자인 APPswe를 발현하는 신경세포주로부터 Aβ의 분비를 감소시켰으며 BACE의 활성을 저해하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.

제안 방법

1 × 106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 24시간 후에 DMSO 또는 SL 5, 20 ㎍/㎖을 처리하였다.
1 × 106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 serum-free DMEM으로 교환하고 16 시간이 경과한 후 DMSO에 용해시킨 SL 5, 20 ㎍/㎖ 또는 양성대조군인 β-secretase inhibitor III22) 1.5 ㎍/㎖를 처리하였다.
APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA21)를 실시하였다.
APPswe 세포주에 SL 각각 5, 20 ㎍/㎖을 처리한 후 배양액으로 분비된 Aβ의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하여 비교 정량한 결과를 Fig. 1에 나타내었다.
APPswe cells were treated with DMSO(control), 5, or 20 ㎍/^㎖ of SL for 24h, then collected conditioned media and lysed with cell lysis buffer. Medium or detergent lysates were loaded on the 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE, or 16.5% Tris-tricine SDS-PAGE and analyzed by immunoblotting with rabbit anti-APP polyclonal antibody, rabbit anti-PS1 polyclonal antibody, rabbit anti-actin polyclonal antibody, or anti-APP monoclonal antibody. Note that β-CTF was decreased and sAPPα was increased in a dose dependent manner.
SL에 의한 Aβ 분비 감소효과도 이들 효소활성의 저해가 원인일 것으로 예측되어 BACE에 의한 APP의 대사체인 β-CTF와 α-secretase에 의한 대사체인 sAPPα의 단백질 양상을 분석함으로 β-secretase의 효소활성을 간접적으로 측정하였다.
Aβ (35-40) 특이적 monoclonal antibody 또는 Aβ(38-42) 특이적 polyclonal antibody가 각각 coating된 plate에 100 ㎕의 시료를 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시키고 7회 세척한 후, HRP conjugation된 Aβ (11-28) 특이적 monoclonal antibody를 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 9회 세척한 후 tetramethyl benzidine (TMB) 기질액을 넣고 실온에서 30분간 반응시킨 후 정지액을 100 ㎕ 첨가하여 450 nm에서 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
단백질 50 ㎍을 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE 및 16.5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한 후, immunoblotting에 의해 APP, PS1, β-CTF (COOH terminal fragment), sAPP(soluble APP), sAPPα 등의 단백질 양상을 검출하였다.
또한, PS의 단백질 양상분석을 통하여 SL의 γ-secretase에 대한 영향을 분석하였다.
음성 대조군(C)인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 분비량을 100%로 하여 SL 처리시 분비량을 백분율로 표시하였다.

대상 데이터

APP swedish 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세포주인 Neuro2a (APPswe)를 동경대학의 Iwatsubo 교수로부터 제공받아 5% FBS (Gibco, Grand Island, NY), L-glutamic acid, penicillin/streptomycin, hygromycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagel's Medium (Gibco, Grand Island, NY)과 OPTI MEM (Gibco, Grand Island, NY)의 혼합 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
蘇合香 (Styrax Liquides, 이하 'SL'로 略함)은 경동시장에서 구입하여 일정량의 DMSO에 용해하여 사용하였다.

데이터처리

각 실험군 간의 유의성 검정은 Student's t-test로 하였으며, P값이 0.05 및 0.01 이하를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.

이론/모형

단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다²³⁾. 1 × 10⁶ 세포를 60 mm dish에서 배양하여 24시간 후에 DMSO 또는 SL 5, 20 ㎍/㎖을 처리하였다.

성능/효과

그러나 BACE에 의한 대사 물질인 β-CTF의 경우는 SL의 농도 의존적으로 감소 양상을 보여, DMSO 처리군(C)에 비해 SL 20 ㎍/㎖ 농도에서 73%가 감소되었다(Fig. 3A).
또한, Aβ의 생성에 관여하는 β-secretase의 효소활성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 간접적으로 확인하였다.
이 결과를 통하여 holo APP 및 APP의 최종 대사과정에 관여하는 효소 γ-secretase 복합체의 중요한 구성분자중 하나인 PS-NTF의 안정성에는 영향이 없으며, 다른 구성분자인 PS1-CTF, NCT, PEN2, APH-1 등의 안정성에도 변화가 없음을 예상할 수 있다.

후속연구

향후 蘇合香에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하고, BACE의 in vitro 효소활성도 직접 측정해야 할 것이다. 새로이 합성되는 APP의 경시적인 변화양상을 확인함으로써 APP의 maturation과 trafficking에 미치는 영향 및 γ-secretase의 활성에 대한 영향도 세밀하게 분석해야 할 것이다. 나아가 蘇合香의 유효성분의 규명도 필요하다.
최근 β-secretase 저해제가 치료제 개발의 표적이 되고 있으므로 SL을 치매 약물의 개발을 위한 후보약물로 응용할 수 있다고 사료된다.
향후 蘇合香에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하고, BACE의 in vitro 효소활성도 직접 측정해야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	2010년 한국의 노인인구 비율은 얼마인가?	이미 고령화 사회로 진입한 한국은 2010년 현재 노인인구 비율이 11%를 차지하며 치매환자의 수도 급속히 증가하고 있다. 이러한 현실은 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 국가 경쟁력 감소에 따라 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다1).
	현재 치매 개선약물은 어떤 것이 임상에서 사용되는가?	이러한 현실은 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 국가 경쟁력 감소에 따라 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다1). 현재 치매 개선약물로서는 acetylcholine esterase 저해제인 donepezil, galantamine 및 rivastigmine 등이 임상에서 사용되고 있으나 치료효율이 낮고 부작용이 심하여 효과적인 치료제가 없는 실정이다2-4). 치매(dementia)는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력과 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다5).
	치매환자의 수도 급속히 증가로 인한 현실은 어떤 문제점으로 대두되는가?	이미 고령화 사회로 진입한 한국은 2010년 현재 노인인구 비율이 11%를 차지하며 치매환자의 수도 급속히 증가하고 있다. 이러한 현실은 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 국가 경쟁력 감소에 따라 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다1). 현재 치매 개선약물로서는 acetylcholine esterase 저해제인 donepezil, galantamine 및 rivastigmine 등이 임상에서 사용되고 있으나 치료효율이 낮고 부작용이 심하여 효과적인 치료제가 없는 실정이다2-4).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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