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문제 정의
- 기존의 연구를 통해 하고초는 대식세포의 반응산소중간물질의 생성능과 대식세포의 탐식능을 유의하게 증가시켜 세포성 및 체액성 면역과 선천적 면역능을 증가시키는 것으로 보고된 바 있어4) 본 연구에서는 마우스 대식세포를 이용하여 하고초가 세포생존률 및 면역매개물질 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
- . 이와 같은 맥락에서 본 연구의 대상이 되는 하고초(夏枯草 : Prunellae Spica) 역시 淸熱解毒하는 효능2) 이외에 補養血脈하는 효능3)을 중심으로 여성의 陰血을 다스림으로서 부인과 질환의 면역력 증강에 효능이 있을 것으로 사료되어 본 연구를 진행하게 되었다.
- 여성에게 陰血은 생리적인 측면과 병리적인 측면에서 모두 매우 중요하다고 볼 수 있다. 즉, 補養陰血하는 것은 면역력 증강의 의미에서 여성의 건강을 지킴에 있어 기본이 되는 것으로, 본 연구의 대상이 되는 夏枯草 역시 補養血脈하는 본초로, 부인과적인 질환에 있어 다용할 수 있는 본초이며 특히, 治病이 아니 未病의 관점에서 淸熱解毒하는 夏枯草의 효능보다 補血, 散結하는 효능을 활용하여 면역반응 증진을 위한 夏枯草의 연구를 진행하였다.
- 하고초 열수추출물(P runellae Spica Water Extract, PSE)로 마우스 대식세포에 전처리한 다음 cell viability 및 nitric oxide(NO) 생성과 interleukin(IL)-1β, IL-6 및 tumor necrosis factor(TNF)-α등의 cytokine 생성에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 補養血脈하는 효능을 중심으로 한 하고초에 관한 본 연구를 통해 부인과 질환의 면역력 증강 효능을 제시하는 바이다.
제안 방법
- 96 well plate에 1×105 cells/㎖의 cell을 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등 다양한 농도의 PSE와 함께 배지에 담아 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- PSE의 NO 생성 효과를 알아보기 위하여 Weissman 등6,7)의 방법을 응용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 세포배양액 중에 존재하는 NO의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540㎚에서 흡광도를 측정 비교하였다.
- PSE의 cytokine 생성 효과를 알아보기 위하여 Politch 등8)의 방법을 응용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 96 well plate에 1×105 cells/㎖의 cell을 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등 다양한 농도의 PSE와 함께 배지에 담아 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
- PSE의 세포독성 유발 효과를 알아보기 위하여 Mosmann 등5)의 방법을 응용하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104cells/well의 cells을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버린 뒤 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어 주었다.
- 96 well plate에 1×104cells/well의 cells을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 버린 뒤 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어 주었다. 같은 양의 배지와 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등 다양한 농도의 PSE를 각 well에 처리하고 24 혹은 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 PBS에 녹인 1㎎/㎖ MTT를 100 ㎕씩 각 well에 처리하여 알루미늄호일로 차광시킨 후 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
- 배양이 끝난 후 PBS에 녹인 1㎎/㎖ MTT를 100 ㎕씩 각 well에 처리하여 알루미늄호일로 차광시킨 후 2시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 DMSO를 100 ㎕ 처리하고 37℃에서 2시간 방치 후 microplate reader를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 다음 공식으로 계산되었다.
- 배양이 끝나면 상등액을 채취하여 Bio-Plex suspension assay system을 이용, quantitative multiplexed cytokine/chemokine assay를 실시하여 마우스 대식세포의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성을 측정하였다.
- 의 방법을 응용하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 세포배양액 중에 존재하는 NO의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540㎚에서 흡광도를 측정 비교하였다. 이를 위해 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등 다양한 농도의 PSE를 배지에 담아 각 well에 처리하고, 24 혹은 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 60 ㎕을 채취하여 여기에 Griess 시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포배양액 중에 존재하는 NO의 농도를 추정하기 위해 microplate reader를 이용, 540㎚에서 흡광도를 측정 비교하였다. 이를 위해 0, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등 다양한 농도의 PSE를 배지에 담아 각 well에 처리하고, 24 혹은 48시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 60 ㎕을 채취하여 여기에 Griess 시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 NO 생성은 다음 공식으로 계산되었다.
- 하고초를 열수추출하여 얻은 시료 PSE를 마우스 대식세포에 전처리한 다음 배양한 후 cell viability 및 NO 생성과 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 cytokine 생성을 측정, 정상군과 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 filter paper(Advantec No.2, Japan), carbon dioxide(CO2) incuvator(NUAIRE, USA), flask(Falcon, USA), pulverizer(Rong tsong, Taiwan), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), air compressor(Tamiya, Japan), homogenizer(Omni, USA), research microscope(Becton dickinson, USA), centriuge(Hanil, Korea), fume hood(Hanil, Korea), clean bench(Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner(Branson, USA), microplate reader(Molecular devices, USA), microplate reader(Bio-rad, USA), thermo aluminum bath(Fine PCR, USA), vortex mixer(Vision scientific co, Korea), water bath(iNtRON biotech, Korea), ice-maker(Vision scientific co, Korea) 및 Bioplex-200(Bio-rad, USA) 등이다.
- 본 실험을 위해서 ethyl alcohol(Samchun chemical, Korea), methyl alcohol(Samchun chemical, Korea), fetal bovine serum(FBS), dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma, USA), Dulbecco's modied essential medium(DMEM, Sigma, USA), 1×phosphate buffered saline(PBS, Sigma, USA), ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA, Sigma, USA), acetic acid(Sigma, USA), isopropanol(Sigma, USA), trypsin-EDTA(Sigma, USA), MTT(Sigma, USA), NO assay kit(Oxford biomedical research, USA) 및 Bio-Plex cytokine assay kit(Panomics, USA) 등이 사용되었다.
- 실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage(Raw 264.7 cell line)로서, 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. Raw 264.
- 실험에 사용된 하고초(옴니허브, Korea)는 2009년 2월에 구입(NO : 2009-02-0011)하였고, 사용 전 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하였다. 하고초 50g을 정확하게 측정한 뒤 환류추출기에 1차 증류수 2,000 ㎖와 함께 넣은 후 끓는 시점으로부터 2시간 동안 가열하여 추출한 다음 추출액을 filter paper로 감압 여과하고, rotary vacuum evaporator로 농축시켜 농축액을 얻었다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 mean±SD로 나타내었으며, 정상군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student t-test로 분석하여 p-value 값이 0.05 미만일때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. PSE 전처리 후 세포를 배양하여 세포 생존율을 살펴본 결과 24, 48시간 배양 시 80-100%의 세포생존율을 보였다.
- 2. PSE가 마우스 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24, 48시간 배양 시 NO의 생성은 모든 실험군에서 유의하게 증가하였다.
- 3. PSE가 마우스 대식세포의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 IL-1β 생성은 모든 실험군에서 유의하게 증가하였다.
- 4. PSE가 마우시 대식세포의 IL-6 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 IL-6 생성은 모든 실험군에서 유의하게 증가하였다.
- 5. PSE가 마우스 대식세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 TNF-α 생성은 모든 실험군에서 유의하게 증가하였다.
- PSE가 마우스 대식세포의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 24시간 배양 시 정상군이 4.30±0.50인데 비하여, 실험군 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 각각 5.8±0.50, 10.0±0.82 및 15.8±3.33 등으로 나타나 모든 실험군에서 정상군에 비해 IL-1β 생성이 유의하게 증가하였다(Table 3, Fig. 3)
- PSE가 마우스 대식세포의 IL-6 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 24시간 배양 시 정상군이 395.8±74.47인데 비하여, 실험군 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 496.5±19.12, 754.3±88.18 및 1442.8±202.11 등으로 나타나 모든 실험군에서 정상군에 비해 IL-6 생성이 유의하게 증가하였다(Table 4, Fig. 4)
- PSE가 마우스 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 24시간 배양시 정상군에 비하여, 실험군 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 각각 137.14±4.29, 182.16±19.75 및 252.30±21.87 등으로 나타났고, 48시간 배양 시 정상군에 비하여, 실험군 50 , 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 각각 142.83±9.13, 211.85±19.90 및 292.62±16.02 등으로 나타나 모든 실험군에서 정상군에 비해 NO 생성이 유의하게 증가하였다(Table 2, Fig. 2).
- PSE가 마우스 대식세포의 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24, 48시간 배양 시 NO의 생성은 모든 실험군에서 유의하게 증가되었는데, 이는 PSE의 투여가 대식세포를 활성화시켰다는 것을 알 수 있다.
- PSE가 마우스 대식세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과 24시간 배양 시 정상군이 14.3±3.4인데 비하여, 실험군 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 584.4±101.57, 1386.3±215.47 및 2601.3±250.19등으로 나타나 모든 실험군에서 정상군에 비해 TNF-α 생성이 유의하게 증가하였다(Table 5, Fig. 5)
- PSE가 마우스 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 살펴본 결과 24시간 배양시 정상군에 비하여, 실험군 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 각각 100.10±15.00, 81.51±17.44 및 82.02±15.73% 등의 세포생존율을 보였고, 48시간 배양 시 정상군에 비하여, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 등은 각각 97.15±14.25, 93.24±6.78, 89.96±11.22% 등의 세포생존율을 보였다(Table 1, Fig. 1).
- 본 연구에서 PSE가 마우스 대식세포의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 IL-1β 생성은 모든 실험군의 농도에서 유의하게 증가하였다.
- . 본 연구에서 PSE가 마우스 대식세포의 IL-6 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 IL-6 생성은 모든 실험군의 농도에서 유의하게 증가하였다.
- 본 연구에서 PSE가 마우스 대식세포의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전처리 후 24시간 배양 시 TNF-α 생성은 모든 실험군의 농도에서 유의하게 증가하였다.
후속연구
- 이러한 결과는 PSE가 대식세포의 NO와 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 면역매 개인자의 증가를 촉진함으로써, 면역반응의 변화를 유도하고, 특히 세포매개면역반응에 관계하여 세포성면역에 관계하는 것으로 볼 수 있다. 따라서 하고초는 補養陰血하는 한의학적 효능과 관련하여 면역 증강에 유용한 약물로 이용될 수있으며, 특히 陰血이 중요시되는 부인과적 질환과 관련하여 더욱 유용하게 활용될 수 있을 것이라는 가능성을 제시해주었다.
- 본 연구에서 PSE의 세포독성여부를 확인하기 위하여 마우스 대식세포의 생존율을 조사한 바 전처리 후 24, 48시간 배양 시 80-100%의 세포생존율을 보였으며 PSE가 대식세포에 나타내는 세포독성에 대해서는 하고초를 임상에서 사용 시 약물의 용량과 복용기간 조절을 위한 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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