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문제 정의
- 이 방법은 일부 용매에만 적용되고 시료 전처리로서 증류수를 사용하고 있는 제한점이 있다. 따라서, 건강기능식품 중 잔류용매 시험법을 확립하여 건강기능식품에서의 잔류용매분석에 대한 체계적인 자료를 구축, 과학적이고 체계적인 잔류용매 관리의 기초자료로 활용하고자 하였다.
- 본 연구에서 용매 총 11종에 대한 HSS/GC/MS 분석 방법을 개발하였다. 확립한 용매 11종에 대한 HSS/GC/MS 잔류용매 분석 방법은 검출한계(LOD)는 0.
제안 방법
- 11종의 용매 표준품은 hexane, heptane, MeOH 그리고 methylene chloride 4종과 ether, acetone, ethylacetate, methylethylketone, isopropanol, ethanol 그리고 trichloroethylene 7종을 2개의 group으로 나누어 톨루엔으로 희석하여 일정한 농도의 표준용액을 제조하였다. 잔류용매분석을 위하여 화학적으로 유사한 용매는 표준용액을 혼합하여 실험에 사용하였다.
- 이들의 분리도를 근거로 하여 용매 분석에 적합한 칼럼을 선정한 후 GC 주입기 온도, 칼럼 온도 기울기 조건, 칼럼의 flow 및 split ratio등의 GC 조건을 확립하였다. Column을 포함한 GC의 분리 조건의 최종 확인을 위하여 시료 타입별 메트릭스 효과 및 불순물에 대한 간섭을 확인한 후, 최종 GC 조건을 확립하였다.
- 용리시간은 DB-Wax보다 빨라져서 9분이내로 나타났으며 그 결과는 Table 2에 나타내었다. DB-Wax column을 장착하여 flame ionization detector(FID)를 검출기로, DB-FFAP column을 장착하여서는 quadrupole MS Spectrometer로 확인하였으며, 위의 결과를 바탕으로 HSS의 조건 확립을 위한 실험을 수행하였다.
- 데이터를 비교분석한 결과 EtOH를 제외하고 S/N ratio가 모두 10 이상으로 용매의 정량한계는 ppm level임을 확인 할 수 있었다. GC/FID와 GC/MS의 검출한계를 비교분석하기 위하여 0.1 ppm의 용매 4종, 7종 표준액의 검출한계를 구하였다. 구한 결과를 Table 5에 나타내었고 두 기기간의 정량한계는 오히려 GC의 검출기가 더 낮은 것을 알 수 있으며 두 기기 모두 ppm level에서 정량성을 가짐을 알 수 있었다.
- )을 확인하고 용매 cut-off 시간을 정하였다. HSS의 조건을 확립하기 위하여 건강기능식품 중 멀티비타민 파우더, 키토산, 클로렐라 등이 들어있는 gas tight bottle에 용매 각 성분을 syringe로 spike하여 HSS의 파라미터인 가열온도와 시간에 대한 실험을 수행하여 HSS/GC/MS 방법을 확립하였다(6-9). 확립한 HSS/GC/MS 방법을 검증하기 위하여 정밀성, 정확성, 직선성, 회수율 및 감도 등에 관한 실험을 수행한 후 검체 중 잔류용매 모니터링을 실시하였다.
- HSS의 파라미터로서 시간에 대한 실험으로서 앞서 HSS 온도 조건 실험 수행 결과를 근거로 80℃의 온도를 고정하고 11종 용매 약 100 ppm 농도의 혼합용액 100 µL를 주입하고 5, 10, 및 15분에서 실험을 수행하였다.
- HSS의 파라미터로서 온도와 시간 중에 먼저 온도에 대한 실험으로서 용매의 물리적 성질을 근거로 11종 용매 약 100 ppm 농도의 혼합용액 100 µL를 주입하고 50, 60, 70, 80, 및 90℃에서 온도별 5회씩 총 45회의 실험을 수행하였다.
- 6를 사용하였다. 건강기능식품 중 잔류용매 분석법 확립을 위하여 11종의 용매 중 hexane, heptane, MeOH 그리고 MC 4종과 ether, acetone, EA, MEK, IPA, EtOH 그리고 TE 7종을 2개의 group으로 나누어 구분하였다. 분리에 적합한 칼럼을 선정하기 위하여 2개의 그룹으로 나눈 용매 수 ppm 표준용액을 제조하여 용매의 끓는점과 극성도를 고려, 비극성인 DB-1과 DB-5, 중간극성인 DB-1701, 그리고 극성 칼럼인 DB-Wax 과 DB-FFAP에서 각각의 분리도를 확인하였다.
- 이들 시료는 40개 품목의 제품군으로서 고시형 제품을 주로 구입하였고, 판매처와 제품 다양성으로 서울경기지역을 중심으로 제품을 수거하였으며, 시료의 목록은 Table 1에 나타내었다. 건강기능식품의 제품형태는 건강기능식품공전(4)에 수록하고 있는 정제품, 캅셀제품, 환제품, 과립제품, 액상 및 분말 형태로서 프로폴리스 제품의 경우 액상, 정제품 및 캅셀제품을 포함하여 6종 제품 유형의 검체를 분석하였다.
- 건강기능식품이 들어있는 gas tight bottle에 용매 각 성분을 syringe로 spike하여 HSS의 온도별, 시간별 변수에 따른 결과를 확인하여 HSS의 조건 확립 실험을 수행하였다.
- 검체별 평가는 균질화된 영양보충용제품 5 g 시료에 11종의 표준품 100 µL를 주입하여 5번 시행하였다.
- 균질화된 영양보충용제품 5 g 시료에 용매 11종 100 µL를 spike하여 HSS 전처리방법으로 5번 시행분석하였다.
- 극성인 칼럼 DB-Wax와 DB-FFAP에 2그룹으로 나눈 11종의 용매를 분석한 결과, alcohols, hexane 및 heptane의 분리 조건을 좀 더 개선하면 용매 분석에 대한 적합성을 나타낼 것으로 예측되어 최적 조건을 찾기 위한 칼럼 온도, 유속 등에 한 변수를 변경하여 실험을 수행하였다. 용리 순서는 hexane-ether-heptane-acetone-EA-MeOH-MEK-IPA-EtOH-MC-TE로서 7분대에서 나오는 heptane 과 MEK 피크는 broadening이 나타나고 EtOH과 MC는 겹쳐(overlap) 보였다.
- 또한, head space sampling(HSS) 방법을 확립하기 위하여, GC/MS의 MS 조건을 먼저 확인하고자 용매 11종을 GC/MS 시스템에 주입하여 MS 스펙트럼 및 각 용매의 retention time(R.T.)을 확인하고 용매 cut-off 시간을 정하였다. HSS의 조건을 확립하기 위하여 건강기능식품 중 멀티비타민 파우더, 키토산, 클로렐라 등이 들어있는 gas tight bottle에 용매 각 성분을 syringe로 spike하여 HSS의 파라미터인 가열온도와 시간에 대한 실험을 수행하여 HSS/GC/MS 방법을 확립하였다(6-9).
- 위의 결과를 바탕으로 GC의 극성 칼럼 온도 및 시간 등의 분리 조건을 적용하여 각 용매에 대한 GC/MS 조건을 확립하고 최종적으로 HSS 조건을 확립하는 실험을 수행하였다. 먼저, 극성인 칼럼 DB-FFAP로 전환하고 이 칼럼에 적합한 온도조건을 확립하여 11종의 용매를 확인하였다. 용리 순서는 극성도가 같으므로 DB-Wax에서의 결과와 순서는 같고 초기온도는 FFAP의 분석 가능 범위로서 DB-Wax칼럼보다 조금 높은 40℃부터의 조건을 바탕으로 하여 DB-FFAP의 조건을 확립하였다.
- 시료 전처리에 사용되는 물 및 이동상은 초순수를 사용하였다. 모든 실험기구는 분석기기 GC, HSS 및 질량분석기에 영향을 받지 않도록 PP, 테프론 재질 및 환경분석용의 초자 실험기구를 사용하였으며, 초순수로 세척 후 사용하였다.
- 건강기능식품 중 잔류용매 분석법 확립을 위하여 11종의 용매 중 hexane, heptane, MeOH 그리고 MC 4종과 ether, acetone, EA, MEK, IPA, EtOH 그리고 TE 7종을 2개의 group으로 나누어 구분하였다. 분리에 적합한 칼럼을 선정하기 위하여 2개의 그룹으로 나눈 용매 수 ppm 표준용액을 제조하여 용매의 끓는점과 극성도를 고려, 비극성인 DB-1과 DB-5, 중간극성인 DB-1701, 그리고 극성 칼럼인 DB-Wax 과 DB-FFAP에서 각각의 분리도를 확인하였다. 이들의 분리도를 근거로 하여 용매 분석에 적합한 칼럼을 선정한 후 GC 주입기 온도, 칼럼 온도 기울기 조건, 칼럼의 flow 및 split ratio등의 GC 조건을 확립하였다.
- 용매의 분리를 위해 GC 분석을 수행하였으며, 비극성, 중간 극성, 극성 칼럼을 사용하여 비교 실험을 수행하였다. 분리하고자 하는 용매 중 hexane, ether, TE, MC 그리고 EA가 비극성이므로 먼저 비극성 칼럼에 대한 분리도 실험을 수행하였다. 비극성 칼럼 DB-1, DB-5는 용매간의 분리가 거의 일어나지 않았으며, 중간극성인 DB-1701의 경우에도 ether와 EA가 겹쳐 하나의 peak처럼 보였다.
- 시료 5g에 용매 7종 혼합액과 4종 혼합액 각각을 100 µL씩 주입하여 11종의 HSS의 회수율을 구하였다.
- 시료는 무게 약 2g을 취하여 HSS용 20 mL vial에 넣고, 이미 확립한 HSS의 조건 80℃에서 10분간 가열한 후, vial 상층부에 있는 vapour 100 µL를 주입하여 실험을 수행하였으며, 분석 조건 검증을 위하여 총 104건의 건강기능식품 시료를 분석하였다.
- 시료의 처리는 메트릭스 효과 및 불순물에 의한 간섭을 파악하여 주위환경 및 분석 여건에 크게 영향을 받지 않는 분석 조건을 최종 확립하고자 메트릭스별 HSS를 통해 얻어진 MS Chromatogram을 비교 검토하였다. HSS는 가열되어 발생한 vapour를 분석하는 것으로서(10-12), Fig.
- 실험방법 중 표준액에서와 같이 4종, 7종으로 분류된 용매 각각을 1mL씩 혼합한 후, 혼합액을 10, 20, 50, 100, 및 500배 희석하였다. 영양보충용제품 시료 5g이 든 HSS vial에 희석한 용액 4종은 0.
- 확립한 HSS/GC/MS법에 대한 용매 11종의 머무름 재현성을 살펴 보았다. 앞서, 각 성분에 대한 세기의 재현성을 이미 Table 6에서 CV(%)로 고찰하였으므로, 여기서는 머무름의 재현성을 분석하였다. 용매 11종의 멀티비타민 제품에서 각 용매별 5회씩, 총 55회의 결과를 통하여 각 성분을 분석하였으며, 각 성분의 표준 농도에서 머무름의 CV(%)는 0.
- 영양보충용제품 시료 5g이 든 HSS vial에 희석한 용액 4종은 0.25, 2.50, 12.50, 25.00, 62.50 및 125.00 pg/g이 되도록, 7종은 0.14, 1.43, 7.14, 14.29, 35.71 및 71.43 pg/g이 되도록 100 µL를 spike하였다.
- 용매의 분리를 위해 GC 분석을 수행하였으며, 비극성, 중간 극성, 극성 칼럼을 사용하여 비교 실험을 수행하였다. 분리하고자 하는 용매 중 hexane, ether, TE, MC 그리고 EA가 비극성이므로 먼저 비극성 칼럼에 대한 분리도 실험을 수행하였다.
- 위의 결과를 바탕으로 GC의 극성 칼럼 온도 및 시간 등의 분리 조건을 적용하여 각 용매에 대한 GC/MS 조건을 확립하고 최종적으로 HSS 조건을 확립하는 실험을 수행하였다. 먼저, 극성인 칼럼 DB-FFAP로 전환하고 이 칼럼에 적합한 온도조건을 확립하여 11종의 용매를 확인하였다.
- 분리에 적합한 칼럼을 선정하기 위하여 2개의 그룹으로 나눈 용매 수 ppm 표준용액을 제조하여 용매의 끓는점과 극성도를 고려, 비극성인 DB-1과 DB-5, 중간극성인 DB-1701, 그리고 극성 칼럼인 DB-Wax 과 DB-FFAP에서 각각의 분리도를 확인하였다. 이들의 분리도를 근거로 하여 용매 분석에 적합한 칼럼을 선정한 후 GC 주입기 온도, 칼럼 온도 기울기 조건, 칼럼의 flow 및 split ratio등의 GC 조건을 확립하였다. Column을 포함한 GC의 분리 조건의 최종 확인을 위하여 시료 타입별 메트릭스 효과 및 불순물에 대한 간섭을 확인한 후, 최종 GC 조건을 확립하였다.
- HSS의 조건을 확립하기 위하여 건강기능식품 중 멀티비타민 파우더, 키토산, 클로렐라 등이 들어있는 gas tight bottle에 용매 각 성분을 syringe로 spike하여 HSS의 파라미터인 가열온도와 시간에 대한 실험을 수행하여 HSS/GC/MS 방법을 확립하였다(6-9). 확립한 HSS/GC/MS 방법을 검증하기 위하여 정밀성, 정확성, 직선성, 회수율 및 감도 등에 관한 실험을 수행한 후 검체 중 잔류용매 모니터링을 실시하였다. 균질화된 영양보충용제품 5 g 시료에 용매 11종 100 µL를 spike하여 HSS 전처리방법으로 5번 시행분석하였다.
- 확립한 HSS/GC/MS법에 대한 용매 11종의 머무름 재현성을 살펴 보았다. 앞서, 각 성분에 대한 세기의 재현성을 이미 Table 6에서 CV(%)로 고찰하였으므로, 여기서는 머무름의 재현성을 분석하였다.
대상 데이터
- 43 pg/g이 되도록 100 µL를 spike하였다. Table 3에서와 같은 HSS 조건으로 시료를 처리하여 HSS/GC/MS로 분석하여 11종 용매의 검량선을 구하였다. Hexane의 검량선의 계산식은 y=1458.
- 본 실험을 수행하는데 사용하는 주요 분석기기는 Gas Chromatograph(GC)와 GC/MS(MS Spectrometer)로서, GC는 GC 2010(Shimadzu, Kyoto, Japan)를, 검출기는 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector, FID, Shimadzu, Kyoto, Japan)를, column은 DB-1, DB-5, DB-1701, DB-Wax 그리고 DB-FFAP(0.25 mm I.d.×30 m, 0.25 µm, Agilent, Palo Alto, CA, USA)와 carrier gas로 99.99% helium gas를 사용하였다.
- 실험에 사용된 용매는 isopropanol(IPA, HPLC grade, Dae Jung, SeouL, Korea), hexane, ethylacetate(EA) 및 methylenechloride(MC) (HPLC grade, Burdick&Jackson, Ulsan, Korea), heptane(HPLC grade, Tedia, OH, USA), acetone, methylethylketone(MEK), ethanol(EtOH), trichloroethylene(TE) 및 ether(HPLC grade, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)를 사용하였다.
- 시료는 무게 약 2g을 취하여 HSS용 20 mL vial에 넣고, 이미 확립한 HSS의 조건 80℃에서 10분간 가열한 후, vial 상층부에 있는 vapour 100 µL를 주입하여 실험을 수행하였으며, 분석 조건 검증을 위하여 총 104건의 건강기능식품 시료를 분석하였다. 이들 시료는 40개 품목의 제품군으로서 고시형 제품을 주로 구입하였고, 판매처와 제품 다양성으로 서울경기지역을 중심으로 제품을 수거하였으며, 시료의 목록은 Table 1에 나타내었다. 건강기능식품의 제품형태는 건강기능식품공전(4)에 수록하고 있는 정제품, 캅셀제품, 환제품, 과립제품, 액상 및 분말 형태로서 프로폴리스 제품의 경우 액상, 정제품 및 캅셀제품을 포함하여 6종 제품 유형의 검체를 분석하였다.
- 11종의 용매 표준품은 hexane, heptane, MeOH 그리고 methylene chloride 4종과 ether, acetone, ethylacetate, methylethylketone, isopropanol, ethanol 그리고 trichloroethylene 7종을 2개의 group으로 나누어 톨루엔으로 희석하여 일정한 농도의 표준용액을 제조하였다. 잔류용매분석을 위하여 화학적으로 유사한 용매는 표준용액을 혼합하여 실험에 사용하였다.
- 확립한 분석 방법을 통해 104건의 건강기능식품의 용매 분석을 실시하였다. 모든 시료에 대하여 확립한 HSS/GC/MS을 적용하여 11종에 대한 스크리닝을 실시하여 분석한 결과를 Table 7에 나타내었다.
데이터처리
- 99% helium gas를 사용하였다. GC/MS의 GC는 CP-3800(Varian, Palo Alto, CA, USA)을 MS는 1200L(Varian)로서 quadrupole analyzer를 사용하였으며 데이터 처리 및 기기운용 프로그램으로서 Varian MS software 6.6를 사용하였다. 건강기능식품 중 잔류용매 분석법 확립을 위하여 11종의 용매 중 hexane, heptane, MeOH 그리고 MC 4종과 ether, acetone, EA, MEK, IPA, EtOH 그리고 TE 7종을 2개의 group으로 나누어 구분하였다.
- 균질화된 영양보충용제품 5 g 시료에 용매 11종 100 µL를 spike하여 HSS 전처리방법으로 5번 시행분석하였다. 감도는 바탕선의 값에 대한 용매의 감도가 3.3이상인 농도를 구하였고, 정밀성은 각 용매 표준품 면적의 표준편차를 피이크 면적의 평균값으로 나눈 비의 백분율 CV(Coefficient of variation, %)로서 구하였고, 정확성(accuracy)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로 구하였다.
- 검체별 평가는 균질화된 영양보충용제품 5 g 시료에 11종의 표준품 100 µL를 주입하여 5번 시행하였다. 정밀성은 각 용매 표준품 면적의 표준편차를 피이크 면적의 평균값으로 나눈 비의 백분율 CV(coefficient of variation, %)로서 구하였고, 정확성(accuracy)은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로 구하였다. Table 4는 용매 11종에 대한 정확성과 정밀성을 나타내었다.
성능/효과
- 시간별 비교한 결과 10 min에서 가장 높은 감도를 보이는 것을 알 수가 있었다. HSS 조건 80℃, 10분에서의 데이터를 기준으로 하여 온도에 따른 검출값 비교를 Fig. 3에 나타내었으며, HSS 조건 중 시간은 10분이 제일 적합한 파라미터임을 알 수 있었다.
- 9과 같이 용매별 회수율의 편차가 적고 회수율이 높은 것으로 보아 이는 closed system에서의 휘발된 용매의 소실이 적은 것으로 이해될 수 있으며 Table 6에 그 결과를 나타내었다. HSS로 용매를 spike한 시료의 전처리 결과, 회수율은 51.0-104.6%, 평균값은 87.9% 그리고 CV(%)는 0.0-38.1%이고 CV 평균값은 6.9%였다. 시료 전처리 HSS의 회수율의 저하는 MeOH를 제외하고 거의 없음을 알 수 있다.
- Table 3에서와 같은 HSS 조건으로 시료를 처리하여 HSS/GC/MS로 분석하여 11종 용매의 검량선을 구하였다. Hexane의 검량선의 계산식은 y=1458.7E+04X+1.12E+09(r2=0.9793)로서, 0.1-125 pg/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었으며, 나머지 10종의 결과에서도 평균 상관계수(r2)는 0.9961로 직선성을 나타내었다. Table 4은 용매 11종에 대한 검량선의 기울기, y 절편 및 상관계수를 나타내었다.
- 건강기능식품 중의 주정과 같은 용매를 포함한 11종의 잔류용매에 대한 분석 방법으로 HSS/GC/MS 방법을 개발하였고, 이 방법은 잔류용매에 대한 분석법의 확대와 잔류용매 실태관리를 위한 가치있는 방법이라고 사료된다. 건강기능식품 중 잔류용매의 신속 검사체계 방법을 확립하였으며, 이 검사방법은 ppm level의 미량 성분까지도 분석이 가능하였다.
- 2에 나타내었다. 그 결과, 5번의 평균값을 통해서도 HSS 조건 중 80℃가 제일 적합한 파라미터 임을 알 수 있었다. 이는 용매의 물리적 성질에서 용매의 끓는점이 제일 높은 heptane, TE의 경우에서 알 수 있듯이 높은 온도 80℃가 vapour 생성에 유리하고 오히려 90℃는 vapour의 운동성을 증가시켜 용매 소실의 우려가 있을 수 있는 가능성을 시사해준다.
- 8c이다. 데이터를 비교분석한 결과 EtOH를 제외하고 S/N ratio가 모두 10 이상으로 용매의 정량한계는 ppm level임을 확인 할 수 있었다. GC/FID와 GC/MS의 검출한계를 비교분석하기 위하여 0.
- 그러나, 본 연구에서 수행하는 HSS/GC/MS 방법은 closed system으로서 증기화된 용매를 주입하여 정량하는 분석방법이다. 따라서, HSS/GC/MS 방법은 잔류용매 분석에 관한 정량 및 정성 그리고 스크리닝 할 수 있는 가능성을 시사해 줌을 알 수 있었다. 또한, 이러한 가능성이 미량의 유해물질이 혼입되었을 경우에도 검출이 용이하게 될 수 있음을 시사해 준다.
- 32였다. 따라서, 건강기능식품 중 용매 11종에 대한 본 HSS/GC/MS 분석법은 건강기능식품 중 잔류용매 검사 방법에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 회수율을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 6%, 변동계수는 15%이하임을 확인 할 수 있었다. 또한, 확립한 시험방법 HSS/GC/MS를 이용하여 104건의 건강기능식품 중의 잔류용매 검증을 실시한 결과, 주정의 경우 에탄올로서 18건이 검출되었고, 그 외는 검출되지 않았다.
- 용리 순서는 hexane-ether-heptane-acetone-EA-MeOH-MEK-IPA-EtOH-MC-TE로서 7분대에서 나오는 heptane 과 MEK 피크는 broadening이 나타나고 EtOH과 MC는 겹쳐(overlap) 보였다. 분리도 개선을 위하여 GC 주입기의 flow와 split ratio를 변경하여 DB-Wax 칼럼에서 용매 11종을 분석한 결과, 극성인 칼럼 DB-Wax에서의 분석결과는 Fig. 1에서와 같이 11개의 용매가 4분 이후부터 13분 이내에 모두 검출되었다. DB-Wax에서의 용리순서는 hexane-ether-heptane-acetone-EA-MEK-MeOH-MC-IPA-EtOH-TE로서 Table 2에 그 결과를 나타내었다.
- 분리하고자 하는 용매는 모두 formula weight(F.W.) 150 이하, 끓는점 100℃ 이하이며, 용매 11종을 녹이는 용매로서 톨루엔은 극성 칼럼에서 분석물질인 11종 용매보다 나중에 나오는 것을 확인하고 MS Spectrometer(MS)의 분석 범위를 확립하였다. 그 결과, DB-FFAP column에서 용매 11종을 GC/MS에서 질량분석기의 분석범위는 30-250 Da, 분석시간은 15분까지 0.
- HSS의 파라미터로서 시간에 대한 실험으로서 앞서 HSS 온도 조건 실험 수행 결과를 근거로 80℃의 온도를 고정하고 11종 용매 약 100 ppm 농도의 혼합용액 100 µL를 주입하고 5, 10, 및 15분에서 실험을 수행하였다. 시간별 비교한 결과 10 min에서 가장 높은 감도를 보이는 것을 알 수가 있었다. HSS 조건 80℃, 10분에서의 데이터를 기준으로 하여 온도에 따른 검출값 비교를 Fig.
- 모든 시료에 대하여 확립한 HSS/GC/MS을 적용하여 11종에 대한 스크리닝을 실시하여 분석한 결과를 Table 7에 나타내었다. 시료분석 결과, 18건에서 에탄올로서 발효주정이 검출되었으며, 18건의 검체를 제외한 나머지 검체에서는 용매가 검출되지 않았다.
- 성분 11종에 대한 머무름 시간은 Table 2에서와 같이 2분에서 9분이내에 검출되고, 사용한 톨루엔의 MS로의 검출을 막기 위하여 분석 시간을 15분이내로 제한하였다. 얻은 크로마토그램을 용매가 들어있지 않은 블랭크 검체의 크로마토그램, Fig. 5과 비교하여 볼 때 확립한 HSS/GC/MS 분석조건에서 용매 성분 11종에 대한 분리 상태가 양호함을 알 수 있었다.
- HSS의 파라미터로서 온도와 시간 중에 먼저 온도에 대한 실험으로서 용매의 물리적 성질을 근거로 11종 용매 약 100 ppm 농도의 혼합용액 100 µL를 주입하고 50, 60, 70, 80, 및 90℃에서 온도별 5회씩 총 45회의 실험을 수행하였다. 온도별 얻은 크로마토그램을 비교한 결과 80℃에서 가장 높은 감도를 보이는 것을 알 수 있었다. HSS의 조건 중 온도 80℃에서 얻은 크로마토그램에서 각 용매 11종의 면적 값을 기준으로 하여 다른 온도에 따른 검출값의 비교 결과를 Fig.
- 먼저, 극성인 칼럼 DB-FFAP로 전환하고 이 칼럼에 적합한 온도조건을 확립하여 11종의 용매를 확인하였다. 용리 순서는 극성도가 같으므로 DB-Wax에서의 결과와 순서는 같고 초기온도는 FFAP의 분석 가능 범위로서 DB-Wax칼럼보다 조금 높은 40℃부터의 조건을 바탕으로 하여 DB-FFAP의 조건을 확립하였다. 용리시간은 DB-Wax보다 빨라져서 9분이내로 나타났으며 그 결과는 Table 2에 나타내었다.
- 앞서, 각 성분에 대한 세기의 재현성을 이미 Table 6에서 CV(%)로 고찰하였으므로, 여기서는 머무름의 재현성을 분석하였다. 용매 11종의 멀티비타민 제품에서 각 용매별 5회씩, 총 55회의 결과를 통하여 각 성분을 분석하였으며, 각 성분의 표준 농도에서 머무름의 CV(%)는 0.15-0.55이고 평균치는 0.32였다. 따라서, 건강기능식품 중 용매 11종에 대한 본 HSS/GC/MS 분석법은 건강기능식품 중 잔류용매 검사 방법에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 회수율을 갖고 있음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 용매 총 11종에 대한 HSS/GC/MS 분석 방법을 개발하였다. 확립한 용매 11종에 대한 HSS/GC/MS 잔류용매 분석 방법은 검출한계(LOD)는 0.1 pg/g이고, 정량범위는 0.1-125 pg/g으로서 평균 상관계수(R2)는 0.9961로서 ppm수준에서 정량성을 가지며, 회수율은 51.0-104.6%, 변동계수는 15%이하임을 확인 할 수 있었다. 또한, 확립한 시험방법 HSS/GC/MS를 이용하여 104건의 건강기능식품 중의 잔류용매 검증을 실시한 결과, 주정의 경우 에탄올로서 18건이 검출되었고, 그 외는 검출되지 않았다.
- 시료 5g에 용매 7종 혼합액과 4종 혼합액 각각을 100 µL씩 주입하여 11종의 HSS의 회수율을 구하였다. 회수율 결과는 Fig. 9과 같이 90.4%정도 나타내는 것을 알 수 있었으며, 알코올 종류 중 MeOH의 회수율이 가장 낮았다. 이는 시료 타입별 회수율 결과인 Fig.
후속연구
- 건강기능식품 중 잔류용매의 신속 검사체계 방법을 확립하였으며, 이 검사방법은 ppm level의 미량 성분까지도 분석이 가능하였다. 또한, 이 검사 방법은 정량성이 확보된 분석 방법으로서, 공정시험법의 제개정 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- Table 4에서와 같이 HSS/GC/MS 분석방법은 정량성이 뛰어남을 알 수 있었다. 또한, 이 방법은 잔류용매의 정량에 대한 분석법으로 활용될 가능성을 보여주었다. 기존 식품 첨가물공전의 증류두 방법(5)은 ppm level에서 분석을 수행하지만 제한된 용매를 사용하고 비중에 따라 증류두를 다르게 사용하며, 냉각탑의 효율에 따라 회수된 용매의 소실이 우려된다.
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