[국내논문]유근피 추출물이 RBL-2H3 비만세포에서 ${\\beta}$-hexosaminidase 및 cytokine 분비에 미치는 효과 Inhibitory effect of Ulmus davidiana on ${\\beta}$-hexosaminidase release and cytokine production in RBL-2H3 cells원문보기
Objectives : Ulmus davidiana (UD) has been widely used in Korean herbal medicines used for treatment of acute and chronic inflammatory diseases, such as rhinitis, asthma, and abscess. In this study, To investigated the protective effect of UD on type 1 allergic response, we determined whether UD inh...
Objectives : Ulmus davidiana (UD) has been widely used in Korean herbal medicines used for treatment of acute and chronic inflammatory diseases, such as rhinitis, asthma, and abscess. In this study, To investigated the protective effect of UD on type 1 allergic response, we determined whether UD inhibits early and late allergic response. Methods : The effect of UD was analyzed by ELISA and RT-PCR in RBL-2H3 cells. Levels of ${\beta}$ -hexosaminidase, interleukin (IL)-4 and TNF-${\alpha}$ were measured using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). mRNA levels of COX-2 and T-helper type 2(Th2) cytokines were analyzed with RT-PCR. Results : We found that UD suppressed ${\beta}$-hexosaminidase release in RBL-2H3 not only by the PMA plus A23187 stimulation, but also by the IgE-DNP-HSA stimulation at the antigen-antibody binding stage and antibody-receptor binding stage. UD also significantly inhibited COX2 level, along with reduced Th2 cytokine levels, such as IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, and TNF-${\alpha}$ in RBL-2H3. Conclusions : Our results indicate that UD protects against type 1 allergic response and exerts an anti-inflammatory effect through the inhibition of degranulation and expression of COX2 and Th2 cytokines.
Objectives : Ulmus davidiana (UD) has been widely used in Korean herbal medicines used for treatment of acute and chronic inflammatory diseases, such as rhinitis, asthma, and abscess. In this study, To investigated the protective effect of UD on type 1 allergic response, we determined whether UD inhibits early and late allergic response. Methods : The effect of UD was analyzed by ELISA and RT-PCR in RBL-2H3 cells. Levels of ${\beta}$ -hexosaminidase, interleukin (IL)-4 and TNF-${\alpha}$ were measured using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). mRNA levels of COX-2 and T-helper type 2(Th2) cytokines were analyzed with RT-PCR. Results : We found that UD suppressed ${\beta}$-hexosaminidase release in RBL-2H3 not only by the PMA plus A23187 stimulation, but also by the IgE-DNP-HSA stimulation at the antigen-antibody binding stage and antibody-receptor binding stage. UD also significantly inhibited COX2 level, along with reduced Th2 cytokine levels, such as IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, and TNF-${\alpha}$ in RBL-2H3. Conclusions : Our results indicate that UD protects against type 1 allergic response and exerts an anti-inflammatory effect through the inhibition of degranulation and expression of COX2 and Th2 cytokines.
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문제 정의
본 연구는 RBL-2H3 세포를 이용한 제 1형 알러지 반응에 초점을 맞추어 in vitro 항알러지 활성을 조사하였다. 초기반응을 유도하는 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase 분비와 후기반응을 유도하는 사이토카인의 생산과 mRNA 발현에 미치는 유근피 추출물의 억제효과를 살펴보았다.
유근피를 이용한 알러지 질환에 관한 연구는 아나필락시스, 비염, 천식 등이 발표되었다8-10). 본 연구에서는 RBL-2H3 비만세포를 이용하여 제 1형 알러지 반응에서 초기반응과 후기반응의 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
Microplate reader(Molecular Devices Co. Ltd., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4와 TNF-α의 양을 계산하였다.
RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30 분, 94℃에서 5 분간 반응시킨 후 94℃에서 30 초간 denaturation시키고, 55℃에서 30 초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1 분간 extension시키는 cycle을 32 회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5 분간 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 104 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다. UD를 농도별 (0, 0.5, 1, 2 및 4 mg/ml)로 처리한 후 1 시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4 시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30 분, 94℃에서 5 분간 반응시킨 후 94℃에서 30 초간 denaturation시키고, 55℃에서 30 초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1 분간 extension시키는 cycle을 32 회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5 분간 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다(Table 1).
그 후 UD (0, 0.5, 1, 2 및 4 mg/ml)를 처리하여 1 시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양한 후 DNP-HSA (10 μg/ml)를 처리한 후 4 시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10 분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다.
배양액을 제거 한 후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4 시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
본 실험에서 UD (0.5, 1, 2, and 4 mg/ml) 농도에 따른 RBL-2H3 비만세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 UD는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2, and 4 mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig.
알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제 효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 세가지 방법을 사용하여 측정하였다. 비면역학적 반응으로 UD 처리 후 PMA와 A23187로 자극하였으며, 면역반응으로 항원-항체 결합단계와 항체-수용체 결합단계에서 측정하기 위하여 UD를 IgE 감작단계와 항원자극단계에서 처리하였다.
5 μg/ml)로 감작하고 37℃ 5% CO2incubator에서 24시간 배양한다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 UD를 농도별 (0, 1, 2 및 4 mg/ml)로 세포에 처리하였다. 1 시간 동안 배양한 후 PBS로 2 번 세척한 다음 DNP-HSA(10 μg/ml)로 자극한 후 1 시간 동안 배양하였다.
알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제 효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 세가지 방법을 사용하여 측정하였다.
초기반응을 유도하는 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase 분비와 후기반응을 유도하는 사이토카인의 생산과 mRNA 발현에 미치는 유근피 추출물의 억제효과를 살펴보았다.
항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase의 분비에 미치는 영향을 측정하기 위하여 RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 105 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하였다.
대상 데이터
RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line)은 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다.
본 실험에 사용된 anti-dinitrophenyl (DNP) immunoglobulin E (IgE), DNP-HSA는 Sigma(USA)로부터, Dulbecco's modification Eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin 및 trypsin-EDTA solution은 Gibco BRL로부터, tetrazolium bromide salt (MTT) 및 dimethylsulfoxide(DMSO)는 Amresco로부터, Interleukin (IL)-4와 tumor necrosis factor alpha (TNF-α) kit는 BD Biosciences Pharmingen으로부터, RT-PCR kit(AccuPower RT/PCR PreMix)는 Bioneer로부터 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 유근피 (Ulmus davidiana : UD)는 갑당약초 (홍천, 강원도)에서 구입하여 사용하였다. UD 600 g을 증류수로 水洗하여 4 L의 증류수를 加하여 6 시간 동안 가열 추출하였다.
RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line)은 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
데이터처리
成績은 SPSS 17.0K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준편차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다.
05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하였다.
이론/모형
IL-4 (A) and TNF-α (B) concentration was measured from cell supernatant using ELISA method.
RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT법을 사용하였다11). RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 104 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다.
성능/효과
PMA+A23187자극에 의한 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 61.82±3.81%, 1 mg/ml 농도에서 95.10±14.34%, 2 mg/ml 농도에서 105.60±3.84%, 4 mg/ml 농도에서 121.70±22.43%로 나타나 농도의존적으로 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2A).
RBL-2H3 cells에서의 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, TNF-α와 COX-2 mRNA의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, UD (1, 2, and 4 mg/ml)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아본 결과 UD를 처리하지 않은 세포는 0.58±0.02의 흡광도를 나타내었고, UD를 농도별(0.5, 1, 2, and 4 mg/ml)로 처리한 세포에서 각각 0.57±0.02 (98%), 0.81±0.04 (140%), 1.18±0.03 (203%), 1.35±0.04 (233%)의 흡광도를 나타내어 농도 의존적으로 세포생존 및 증식이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1).
결론적으로 UD는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알러지의 초기반응과 후기반응을 조절하였다. 비면역학적 또는 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만 세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다.
5, 1, 2, and 4 mg/ml) 농도에 따른 RBL-2H3 비만세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 UD는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2, and 4 mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig. 1).
또한 RBL-2H3 cells에서 분비된 TNF-α의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 5.35±0.72 pg/ml이었으며, 항원으로 자극한 세포에서 21.58±2.38 pg/ml로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었다.
또한 UD가 Th2 반응을 지속시키는 사이토카인의 생성을 억제하는지 조사한 결과 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF 및 TNF-α mRNA의 발현을 억제하였고, 특히 IL-5, IL-13과 GM-CSF mRNA의 발현은 UD (1, 2, and 4 mg/ml) 모든 농도에서 현저하게 감소시켰다(Fig. 4).
또한 UD는 IgE 매개 면역자극에서 항원-항체 결합과 항체-수용체 결합을 모두 제어함으로써 β-hexosaminidase의 분비를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2B, 2C).
본 실험에서 UD가 IgE 매개 알러지 반응에서 cyclooxygenase 활성을 억제하는지 조사한 결과 COX2 mRNA의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 특히 2 mg/ml과 4 mg/ml의 농도에서 현저하게 억제하였다.
본 실험에서 UD는 IgE 매개 알러지 반응에서 IL-4와 TNF-α의 생산을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 3A, 3B).
본 실험에서 UD는 비면역학적 자극에 대해 β-hexosaminidase의 분비를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 2A).
결론적으로 UD는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알러지의 초기반응과 후기반응을 조절하였다. 비면역학적 또는 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만 세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다. 또한 지방성분의 매개물질과 후기 Th2 사이토카인 mRNA의 발현을 감소시켰다.
RBL-2H3 cells에서의 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, TNF-α와 COX-2 mRNA의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, UD (1, 2, and 4 mg/ml)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 특히 IL-5, IL-13, GM-CSF와 COX2 mRNA의 발현은 UD (1, 2, and 4 mg/ml) 모든 농도에서 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 4).
항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 14.41±3.89%, 1 mg/ml 농도에서 22.46±9.′ # 墻, 2 mg/ml 농도에서 38.81±11.73%, 4 mg/ml 농도에서 44.48±4.00%로 나타나 농도의존적으로 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2B).
항체-수용체 결합단계에서 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 28.79±8.61%, 1 mg/ml 농도에서 20.12±5.09%, 2 mg/ml 농도에서 47.52±9.05%, 4 mg/ml 농도에서 88.40±3.96%로 나타나 모든 농도에서 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2C).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
제 1형 알러지 반응의 초기반응과 후기반응의 특징은 무엇인가?
제 1형 알러지 반응은 초기반응과 후기반응으로 나눌 수 있다. 초기반응은 수분 내에 발생하여 비만세포로부터 histamine, β-hexosaminidase, serotonin과 같은 이미 생성되어 있는 매개물질과 새로 합성된 지방성분의 매개물질을 분비하고, 후기반응은 수시간 내에 발생하여 T-helper type 2(Th2) 사이토카인을 합성하고 분비하여 염증반응을 지속시킨다3).
제 1형 알러지 반응은 어떠한 항원에 의해 유도되는가?
제 1형 알러지 반응은 음식, 집먼지, 진드기, 화장품, 꽃가루 등의 특정한 항원에 의해 유도된다. 항원이 인체를 자극하여 IgE를 생성 분비하고 비만세포 수용체와 결합하여 복합체를 이루는데, 동일한 항원에 재감작되어 IgE를 교차결합하였을 때 비만세포가 활성화되고 알러지 반응이 시작된다1,2).
제 1형 알러지 반응은 무엇으로 나누어지는가?
항원이 인체를 자극하여 IgE를 생성 분비하고 비만세포 수용체와 결합하여 복합체를 이루는데, 동일한 항원에 재감작되어 IgE를 교차결합하였을 때 비만세포가 활성화되고 알러지 반응이 시작된다1,2). 제 1형 알러지 반응은 초기반응과 후기반응으로 나눌 수 있다. 초기반응은 수분 내에 발생하여 비만세포로부터 histamine, β-hexosaminidase, serotonin과 같은 이미 생성되어 있는 매개물질과 새로 합성된 지방성분의 매개물질을 분비하고, 후기반응은 수시간 내에 발생하여 T-helper type 2(Th2) 사이토카인을 합성하고 분비하여 염증반응을 지속시킨다3).
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