선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 13) 본 연구에서는 섬오가피의 줄기 및 뿌리 추출물의 Th-1 type cytokine인 IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α의 분비에 미치는 영향을 확인하고, 섬오가피의 암 예방 및 치료물질로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 국내자생 섬오가피의 줄기 및 뿌리 추출물의 Th-1 type cytokine인 IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α의 분비에 미치는 영향을 확인하고, 섬오가피의 암 예방 및 치료물질로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 대식세포의 TNF-α 분비에 미치는 섬오가피 추출물의 영향을 알아보기 위하여 LPS로 자극시킨 RAW263.7 세포에 추출물을 처리 후 배양액의 TNF-α의 양을 측정하였다.
제안 방법
- Cytokine 측정을 위한 전 단계로 시료의 세포에 대한 영향을 평가하기 위하여 사용된 6종류의 세포에 대한 시료의 독성여부를 MTT assay에 의하여 확인하였다. 10-4 g/ml에서 시작하여 10배수로 희석한 뿌리(AKR) 및 줄기(AKS) 물 추출물을 각 세포에 처리하여 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 사용된 모든 시료의 농도에서 사용된 세포들의 생존율이 90% 이상인 것으로 보아 세포의 생존에 큰 영향이 없는 것을 알 수 있었다(Table I, II).
- 7-10) 또한 이 세포는, Tc-세포, Th-1 type-세포 및 NK-세포를 활성화 시키는 것으로 확인된 바 있다.25-27) 본 연구에서는 수지상 세포의 IL-12분비에 미치는 섬오가피 추출물의 영향을 알아보기 위하여 LPS를 처리하여 자극시킨 생쥐의 림프계(lymphoid) 수지상세포인 DC1과 골수계(myeloid) 수지상세포인 DC2에 추출물을 처리하여 배양시킨 후 배양액 중의 IL-12의 농도를 측정하였다. 그 결과, 매우 낮은 농도(5×10-17 g/ml)의 추출물을 처리한 DC1 및 DC2 세포에서 IL-12의 분비가 증가하기 시작하는 것으로 나타났다.
- 또한, 항암 면역반응은 cytotoxic T-세포가 종양 항원을 인식함으로써 이루어지며 이러한 Tc-세포의 완전한 활성화를 위해 IL2의 도움이 필요하다.6,11) 본 연구에서는 사람 T-세포인 Jurkat-T 세포와 쥐의 장상피세포인 IEC-6 세포에 섬오가피 추출물을 처리하여 배양한 배양액 중의 IL-2의 농도를 측정하였다. 그 결과, AKS은 Jurkat-T-세포의 IL-2 분비를 약간 증가시키는 것으로 나타났다.
- 96 well plate에 purified anti-mouse interleukin(IL)-12, antihuman IL-2, anti-mouse TNF-α, anti-human IFN-γ, anti-rat IL-2 capture antibody(eBiosciences, San Diego, CA, USA), biotin-conjugated anti-mouse IL-12, anti-human IL-2, antimouse TNF-α, anti-human interferon-γ, anti-rat IL-2 monoclonal antibody(eBiosciences, USA)를 사용하여 세포배양 상등액 중의 cytokine을 측정하였다.
- 그 결과, 사용된 모든 시료의 농도에서 사용된 세포들의 생존율이 90% 이상인 것으로 보아 세포의 생존에 큰 영향이 없는 것을 알 수 있었다(Table I, II). 따라서 이 결과를 토대로, 세포의 생존에 큰 영향이 없는 10-6 g/ml 이하의 추출물을 세포에 처리하여 cytokine 분비실험을 수행하였다.
- 배양액을 제거한 후, DMSO(dimethylsulfoxide, Duksan)용액 200 µl 씩 첨가하고 10분간 흔들어준 후, 595 nm에서 ELISA(enzymelinked immunosorbent assay) reader(Molecular Devices Co.)로 흡광도를 측정하였다.
- 배지로 희석시킨 시료를 세포에 농도 별로 처리하여, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 5 mg/ml) assay로 측정하여 세포에 대한 시료의 독성을 확인하였다. 즉, 1×104 cells/well로 넣은 세포와 시료를 96 well plate에 분주한 다음 48시간 동안 배양하고, MTT 용액을 50 µl씩 첨가하여, 4시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 본 연구에서는 LPS로 자극시킨 NK(NK92MI)-세포에 섬오 가피 추출물을 처리하여 배양액 중의 IFN-γ의 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- Mouse dendritic 세포인 lymphoid 계열의 DC1 세포와 myeloid 계열의 DC2 세포를 서울대학교 의과대학 면역학교실의 강재승 교수로부터 분양 받았다. 그리고 rat 장 상내피세포인 IECs(intestinal epithelial cells)-6 세포, mouse 대식세포인 RAW 264.
- Mouse dendritic 세포인 lymphoid 계열의 DC1 세포와 myeloid 계열의 DC2 세포를 서울대학교 의과대학 면역학교실의 강재승 교수로부터 분양 받았다. 그리고 rat 장 상내피세포인 IECs(intestinal epithelial cells)-6 세포, mouse 대식세포인 RAW 264.7 세포, 사람 T-세포인 Jurkat-T 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받았다. 또한 Human IL-2 cDNA를 transfection 시킨 사람 자연살해세포인 NK92MI 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았다.
- 7 세포, 사람 T-세포인 Jurkat-T 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받았다. 또한 Human IL-2 cDNA를 transfection 시킨 사람 자연살해세포인 NK92MI 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았다.
- 섬오가피 뿌리의 물 추출물(AKR) 및 줄기의 물 추출물(AKS)은 대전생명공학연구소의 이정준 박사팀에서 준비한 시료를 사용하였다. 추출물은 증류수에, 50 mg/ml의 농도로 용해시킨 후, -20℃에 보관하고, 실험 시, 적정 농도로 세포 배양 배지로 희석하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준오차로 나타내었으며 자료분석은 ANOVA test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Cytokine 측정을 위한 전 단계로 시료의 세포에 대한 영향을 평가하기 위하여 사용된 6종류의 세포에 대한 시료의 독성여부를 MTT assay에 의하여 확인하였다. 10-4 g/ml에서 시작하여 10배수로 희석한 뿌리(AKR) 및 줄기(AKS) 물 추출물을 각 세포에 처리하여 세포의 생존율을 측정하였다.
성능/효과
- 1) 이 식물은 전통적으로 강정, 강장 및 진통목적으로 사용되고 있으며, 민간에서 신경통, 류마티스, 고혈압, 중풍, 당뇨, 습진, 거담 등에 사용되어 왔다.1,2) 오가피는 우리나라 전역과 중국 동북부 지방, 러시아의 시베리아, 일본의 북해도 등에 분포하며, 국내에는, 섬오가피(Acanthopanax koreanum Nakai), 흰털오가피(A. divaricatus var. albeofructus), 가시오가피(A. senticosus, Maxim) 등 10여종이 자생 또는 재배되고 있다.1) 가시오가피는 1960년대 러시아 과학자 Breckman에 의해서 범 적응적 효과가 보고된 이래 세계적으로 주목 받기 시작하였으나 우리나라에는 분포도가 그리 높지 않은 것으로 알려져 있다.
- 24) 본 연구에서는 IEC-6 세포에 섬오가피 추출물을 처리하여 IL-2의 분비여부를 확인한 결과, 농도의존적으로 IL-2의 분비가 증가하는 것을 알 수 있었다. 10-11 g/ml 농도의 AKS 및 AKR 추출물을 처리한 결과, IL-2의 분비가 증가하기 시작하였으며, 특히 10-6 g/ml의 AKR을 처리한 경우 IL-2의 분비가 2.03배 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4). 현재, 대부분의 오가피를 경구로 복용하고 있는 점을 고려하면, 복용 후 흡수단계에서 1차적으로 만나는 장상피세포에서의 IL-2의 분비촉진은 매우 의미 있는 결과라고 볼 수 있다.
- Th-세포는 분비되는 cytokine에 의해 다시 Th-1 type(IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α 등)과 Th-2 type(IL-4, IL-6, IL-8, TGF-β 등)으로 나뉜다.12) Th-1/Th-2 세포는 공통의 naive T-세포로부터 분화하며, naive T-세포가 항원자극 후에 IL-12 존재 하에서 분화하면 Th-1 세포로, IL-4 존재 하에서 분화하면 Th-2 세포로, 분화한다.12)
- 24) 본 연구에서는 IEC-6 세포에 섬오가피 추출물을 처리하여 IL-2의 분비여부를 확인한 결과, 농도의존적으로 IL-2의 분비가 증가하는 것을 알 수 있었다. 10-11 g/ml 농도의 AKS 및 AKR 추출물을 처리한 결과, IL-2의 분비가 증가하기 시작하였으며, 특히 10-6 g/ml의 AKR을 처리한 경우 IL-2의 분비가 2.
- 생체 내 정상적으로 존재하는 면역감시기구 중 종양세포를 인지하고 소멸시키는 것은 T-세포나 자연살해세포(natural killer cell, NK cell) 등에 의한 세포성 면역기능의 활성화가 중요한 역할을 한다.6) T-세포의 활성화 과정은 이를 조절하는 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC)의 역할이 선행되어야만 하는데, 수지상 세포(dendritic cell)는 고도로 전문화된 항원제시세포로서 resting/naive T-세포의 강력한 activator이며, 여러 가지 cytokine을 분비한다.7-10)
- AKR 을 처리한 경우에도 IFN-γ의 분비가 약간 증가하였으나, AKS보다 증가 정도가 다소 낮았다.
- 결론적으로 섬오가피 추출물은 Th-1 type cytokine 중 IL-2, IL-12, IFN-γ의 분비를 증가시키나 TNF-α의 분비에는 영향을 주지 않았다.
- 그 결과, AKS를 처리한 경우 IFN-γ의 분비가 농도의존적으로 크게 증가하였으며, 10-7 g/ml 농도의 추출물을 처리하였을 때 IFN-γ의 분비가 2.4배 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
- 6,11) 본 연구에서는 사람 T-세포인 Jurkat-T 세포와 쥐의 장상피세포인 IEC-6 세포에 섬오가피 추출물을 처리하여 배양한 배양액 중의 IL-2의 농도를 측정하였다. 그 결과, AKS은 Jurkat-T-세포의 IL-2 분비를 약간 증가시키는 것으로 나타났다. 추출물의 농도를 5×10-7 g/ml까지 증가시킬 경우 IL-2분비가 1.
- 그 결과, 매우 낮은 농도(5×10-17 g/ml)의 추출물을 처리한 DC1 및 DC2 세포에서 IL-12의 분비가 증가하기 시작하는 것으로 나타났다.
- 10-4 g/ml에서 시작하여 10배수로 희석한 뿌리(AKR) 및 줄기(AKS) 물 추출물을 각 세포에 처리하여 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 사용된 모든 시료의 농도에서 사용된 세포들의 생존율이 90% 이상인 것으로 보아 세포의 생존에 큰 영향이 없는 것을 알 수 있었다(Table I, II). 따라서 이 결과를 토대로, 세포의 생존에 큰 영향이 없는 10-6 g/ml 이하의 추출물을 세포에 처리하여 cytokine 분비실험을 수행하였다.
- 그 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두 대식세포의 TNF-α의 분비에 거의 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었고, 섬 오가피의 정제된 성분인 acanthoic acid를 처리한 Kang 등22)의 결과와는 차이가 있었다.
- 또한 10-12 g/ml 농도 이상의 농도에서는 IFN-γ의 분비가 더 이상 증가하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 5).
- 또한 AKR을 처리한 경우에도 유사한 분비 경향을 보였으며, 5×10-14 g/ml의 추출물을 처리한 DC1세포의 경우 IL-12의 분비가 2.3배 현저하게 증가하였으며, DC1 및 DC2 세포 모두 줄기 추출물을 처리한 경우보다 더욱 낮은 농도에서 최대치를 보였으며, 분비 증가 정도가 더욱 큰 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 결론적으로 섬오가피 추출물은 Th-1 type cytokine 중 IL-2, IL-12, IFN-γ의 분비를 증가시키나 TNF-α의 분비에는 영향을 주지 않았다. 또한 T-세포에 의한 IL-2 분비에는 큰 영향이 없었으나 장상피세포 IEC-6 세포에 의한 IL-2의 분비에는 크게 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 따라서 섬오가피 추출물은 Th-1 type cytokine의 분비를 증가시켜 세포매개성 면역반응을 촉진시켜 세포 내 감염과 종양세포에 대한 숙주의 방어에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
- 의 주장과는 달리 섬오가피 추출물을 전구세포가 다른 생쥐의 림프계 수지상세포 (DC1)와 골수계 수지상세포(DC2)에 처리한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두 Th1 계열의 세포를 유도하는 IL-12의 분비를 촉진 시키는 것으로 나타났다. 또한 뿌리 추출물이 줄기 추출물보다 IL-12의 분비에 미치는 영향이 더욱 컸으며, 10-14~10-13 g/ml 농도의 추출물을 처리하였을 때 분비증가 정도가 가장 큰 것으로 나타났다. 따라서 Sallusto 등33)의 주장대로 면역반응의 유형은 수지상세포로 유도되는 전구세포의 기원이나 분화를 유도하는 자극의 특성 때문이 아니라 항원의 종류 및 양이나 수지상세포가 활성화되고 성숙되는 정도에 따라서 결정되는 것으로 추측된다.
- 또한, 섬오가피 줄기추출물은 NK-세포로부터 IFN-γ의 분비를 크게 증가시켰으며, 뿌리 추출물은 IFN-γ의 분비증가 정도가 낮았다.
- 따라서 Sallusto 등33)의 주장대로 면역반응의 유형은 수지상세포로 유도되는 전구세포의 기원이나 분화를 유도하는 자극의 특성 때문이 아니라 항원의 종류 및 양이나 수지상세포가 활성화되고 성숙되는 정도에 따라서 결정되는 것으로 추측된다. 또한, 섬오가피 추출물은 T-세포의 IL-2 분비에는 거의 영향이 없으나, IEC-6 세포의 IL-2의 분비를 농도의존적으로 현저히 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서, 대부분의 오가피를 경구로 복용하고 있는 점을 고려하면, 복용 후 흡수단계에서 1차적으로 만나는 장상피세포에서의 IL-2의 분비촉진은 매우 의미 있는 결과라고 볼 수 있다.
- 본 연구 결과에서는 Maldonado-Lopez 등31)의 주장과는 달리 섬오가피 추출물을 전구세포가 다른 생쥐의 림프계 수지상세포 (DC1)와 골수계 수지상세포(DC2)에 처리한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두 Th1 계열의 세포를 유도하는 IL-12의 분비를 촉진 시키는 것으로 나타났다. 또한 뿌리 추출물이 줄기 추출물보다 IL-12의 분비에 미치는 영향이 더욱 컸으며, 10-14~10-13 g/ml 농도의 추출물을 처리하였을 때 분비증가 정도가 가장 큰 것으로 나타났다.
- 3). 본 연구에서 사용한 물추출물은 다량의 다당체를 함유할 것으로 미루어 볼때, 섬오가피로부터 분리한 다당체(polysaccharide)가 B-세포를 활성화시키나 T-세포에는 영향이 없다는 보고21)와는 다소 차이가 있는 것을 알 수 있었다.
- 섬오가피 추출물을 전구세포가 다른 수지상세포에 처리한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두 동일하게 Th1 계열의 세포를 유도하는 IL-12의 분비를 촉진시키는 것으로 나타났다. 따라서 Sallusto 등33)의 주장대로 면역반응의 유형은 수지상세포로 유도되는 전구세포의 기원이나 분화를 유도하는 자극의 특성 때문이 아니라 항원의 종류 및 양이나 수지상세포가 활성화되고 성숙되는 정도에 따라서 결정되는 것으로 추측된다.
후속연구
- 또한 T-세포에 의한 IL-2 분비에는 큰 영향이 없었으나 장상피세포 IEC-6 세포에 의한 IL-2의 분비에는 크게 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 따라서 섬오가피 추출물은 Th-1 type cytokine의 분비를 증가시켜 세포매개성 면역반응을 촉진시켜 세포 내 감염과 종양세포에 대한 숙주의 방어에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.