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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Kim등 (2009)에 의해 개발된 옥수수 형질전환방법을 이용하여 국내 양돈산업에 경제적 손실을 유발하는 호흡기 질병 중 하나인 돼지 흉막 폐렴의 항원유전자 (apxIIA)를 도입 시켜 형질전환체를 개발 하였기에 보고 하고자 한다.
가설 설정
- f (bar = 3 mm), g (bar = 1 cm): Shoot and root formation of somatic embryo from selected callus clones on 1st regeneration medium. h: Regenerated plantlets from somatic embryos on germination medium, bar = 3.5 cm. i: Transgenic plantlet in small pots, bar = 1cm.
제안 방법
- 48시간 동안 공동배양 후 각각의 캘러스 클론을 분리하여 delay medium (MS salts, Eriksson’s vitamins, 0.5 mg/L Thiamine-HCl, 1 mg/L 2,4-D, 3 mM MES, 25 mM L-proline, 2% sucrose, 100 mg/L myo-inositol, 100 mg/L casamino acid vitamin assay, 0.7% BBL agar, 1.7 mg/L AgNO3, 300 mg/L cefotaxim sodium, pH 5.8)에 치상하여 5~7일간 25℃에서 암 배양 하였다 (Fig. 2c).
- 8주 이상 계대배양 하면서 선발된 캘러스를 1차 재분화 배지 (MS salts, MS vitamins, 0.1 mg/L 2,4-D, 3 mM MES, 2% sucrose, 100 mg/L myo-inositol, 0.1 mg/L ABA, 150 mg/L asparagine, 0.8% BBL agar, 100 mg/L cefotaxim sodium, 50 mg/L paromomycin, pH 5.8)에 옮겨 25℃, 16시간 광주기 조건에서 2주간 배양하면서 체세포 배를 유도 하였다 (Fig. 2e). 유도된 체세포 배를 다시 2차 재분화 배지 (N6 salts, Eriksson’s vitamins, 0.
- 8% agarose 겔에 전기영동 하였다. Agarose 겔상의 DNA 밴드를 ZetaR-Probe nylon membrane (Bio-Rad, catalog #162-0196)에 옮겨 32P-dCTP (Stratagene, catalog #300385)로 표지된 약 0.55 kb apxIIA probe를 이용하여 Southern 분석하였다 (Southern 1975).
- 각 발현벡터 (pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623)로 형질 전환된 Agrobacterium과 공동 배양한 후 선발배지에서 왕성하게 자라는 캘러스 일부를 선발하여 NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog #PSP73000)로 nptII유전자 발현 여부를 분석하였다. 캘러스 클론으로부터 kit에서 제공한 buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 antibody가 코팅된 96-well plate에 각각 분주한 후 Agdia방법에 따라 분석하였다.
- 3). 또한 NPTII ELISA kit assay법에 의해 1차 선별을 통해 얻은 형질전환 캘러스 클론을 8주 이상 2주 간격으로 계대배양 하면서 선발배지에서 완전하게 적응된 캘러스 클론을 다시 선발하였다. 최종적으로 pMYV611벡터에서 3개 캘러스 클론 (0.
- 미숙배를 무균적으로 분리하여 캘러스 유도배지 (CIM: MS salts, Eriksson’s vitamins, 0.5 mg/L Thiamine-HCl, 1 mg/L 2,4-D, 3 mM MES, 25 mM L-proline, 2% sucrose, 100mg/L myo-inositol, 100 mg/L casamino acid vitamin assay, 0.7% BBL agar, and 1.7 mg/L AgNO3; pH 5.8, Murashige and Skoog 1962)에 치상한 후 24℃ 에서 6주 이상 암 배양 하면서 Type II 배발생 캘러스를 유도하였다.
- 2c). 배양 후 각각의 캘러스 클론을 100 mg/L paromomycin이 포함된 선발 배지로 옮겨 암 조건에서 2주간 간격으로 계대배양 하면서 왕성하게 자라는 캘러스를 선발하였다 (Fig. 2d).
- 온실에서 건강하게 자라는 어린 잎 절편 약 2 g을 채취하여 genomic DNA를 추출하였으며 (Dellaporta et al. 1983), 약 10 ㎍의 DNA를 EcoRI 제한효소 반응액에 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 절단한 후 0.8% agarose 겔에 전기영동 하였다.
- 돼지 흉막폐렴백신을 개발하기 위해 옥수수 HiII genotype 으로부터 유도한 type II형의 배발생캘러스를 식물발현벡터 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623로 형질전환 시킨 Agrobacterium (C58C1)과 공동배양 하였다. 이들 식물발현벡터는 paromomycin 항생제 저항 유전 자인 NPTII 선발마커와 표적 유전자로서 흉막폐렴균의 여러 가지 혈청을 생산하는 apxIIA유전자로 재조합하여 구축하였다. 식물발현벡터pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및V623의 경우 각각 4,120개, 5,959개, 7,581개, 52,329개, 48,948개 및 56,188개의 캘러스 클론을 Agrobacterium과 공동한 후 NPTII assay kit에 의해 nptII유전자의 발현빈도를 조사한 결과 각 벡터별로 2.
- pleuropneumoniae의 다양한 혈청형에서 만들어지며 각 벡터는 다른 크기의 apxIIA 유전자 fragment를 운반한다. 즉 pMYV611과 V621은 CO1-apx5-2 (0.75 kb)를, pMYV613, V622와 V623은 CTB5-2 (0.93 kb)를, pMYV616은 fulllength의 apxIIA 유전자 (1.7 kb)를 각각 운반하도록 재조 합하여 구축하였다. pMYV611의 경우 3’에 ER retension signal과 5’에 Col (M cell binding ligand) sequence를 재조합 하여 구축한 반면, V621은 3’ ER retention signal대신 식물 유래 BIP signal sequence로 구축하였다.
- 2d). 증식된 putative transgenic 캘러스의 일부를 1차 재분화 배지에 옮겨 16시간 광주기 조건으로 2주간 배양하면서 부드러운 배발생캘러스 표면에서 흰색의 단단한 체세포배가 형성되는 것을 관찰 하였고 (Fig. 2e), 이러한 체세포배를 분리하여 2차 재분화 배지와 발아배지에 순차적으로 배양하면서 완전한 유식물체로 분화시켰다 (Fig. 2f, g, h). 유식물체를 토양에 옮겨 5~6일간 배양실에서 충분하게 적응시킨 후 온실로 옮겨 점차 순화시켰고 (Fig.
- 형질전환된 각각의 콜로니를 50 mg/L rifampicin, 50mg/L gentamicin과 50 mg/L kanamycin이 첨가된 YEP배지에 접종하여 28℃에서 2일간 배양하였다. Agrobacterium 배양액을 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 박테리아 pellet을 공동배양액 (CCM: 1/2 MS salts, MS vitamins, 20 mM MES, 0.
대상 데이터
- NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog #PSP73000) 분석에 의해 양성반응을 나타낸 형질전환 캘러스로부터 유도된 식물체에서 T 1종자를 수확한 후 다시 온실에서 발아시켜 유식물체를 Southern분석을 위한 재료로 사용하였다. 온실에서 건강하게 자라는 어린 잎 절편 약 2 g을 채취하여 genomic DNA를 추출하였으며 (Dellaporta et al.
- 돼지 흉막폐렴백신을 개발하기 위해 옥수수 HiII genotype 으로부터 유도한 type II형의 배발생캘러스를 식물발현벡터 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623로 형질전환 시킨 Agrobacterium (C58C1)과 공동배양 하였다. 이들 식물발현벡터는 paromomycin 항생제 저항 유전 자인 NPTII 선발마커와 표적 유전자로서 흉막폐렴균의 여러 가지 혈청을 생산하는 apxIIA유전자로 재조합하여 구축하였다.
- 8, Murashige and Skoog 1962)에 치상한 후 24℃ 에서 6주 이상 암 배양 하면서 Type II 배발생 캘러스를 유도하였다. 유도한 Type II 배발생캘러스를 4주 간격으로 계대 배양하면서 충분하게 증식한 후 Agrobacterium을이용한 형질전환용 배양재료로 이용하였다.
이론/모형
- ApxIIA유전자 발현 벡터로 pMYV611, pMYV613, pMYV 616, V621, V622와 V623을 사용하였으며, 각 벡터는 Agrobacterium tumefaciens strain C58C1에 각각 freeze-thaw 방법으로 형질전환하여 균주로 사용하였다. 각 벡터의 T-DNA 에는 2개의 cassettes가 위치한다 (Fig.
- 각 발현벡터 (pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623)로 형질 전환된 Agrobacterium과 공동 배양한 후 선발배지에서 왕성하게 자라는 캘러스 일부를 선발하여 NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog #PSP73000)로 nptII유전자 발현 여부를 분석하였다. 캘러스 클론으로부터 kit에서 제공한 buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 antibody가 코팅된 96-well plate에 각각 분주한 후 Agdia방법에 따라 분석하였다.
성능/효과
- 세계적으로 주요 사료작물인 옥수수에서 돼지 흉막폐렴의 항원유전자가 발현되는 형질전환체를 개발하는 것은 돼지 흉막폐렴을 예방할 수 있을 뿐 아니라 국내 양돈산업에 있어서도 가치 있는 일이라 할 수 있다. Agrobacterium 과 공동배양 한 HiII genotype의 type II 옥수수 배발생 캘러스는 (Fig. 1a) delay배지를 거쳐 1 mg/L 2,4-D와 100 mg/L paromomycin항생제가 첨가된 선발배지에서 2주 간격으로 암 조건에서 계대 배양 하면서 선발한 결과 약 6~8주후부터 육안으로도 비교될 만큼 생장속도가 빠른 캘러스가 선발되었으며, 이러한 캘러스를 putative transgenic 캘러 스로 선정하여 3달이상 충분하게 증식시켰다 (Fig. 2d). 증식된 putative transgenic 캘러스의 일부를 1차 재분화 배지에 옮겨 16시간 광주기 조건으로 2주간 배양하면서 부드러운 배발생캘러스 표면에서 흰색의 단단한 체세포배가 형성되는 것을 관찰 하였고 (Fig.
- 각 벡터 즉 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및V623의 경우 각각 4,120개, 5,959개, 7,581개, 52,329개, 48,948개 및 56,188개의 캘러스 클론을 Agrobacterium과 공동 배양한 후 4주 후 선발배지에서 선발한 putative transgenic 캘러스를 선발하였고, 이 중 무작위로 선발된 캘러스를 대상으로 NPTII ELISA kit assay를 수행한 결과 양성대조군 수준에서의 반응 정도를 갖는 클론은 pMYV611벡터의 경우 3.0%, pMYV613은 4.4%, pMYV616은 2.3%, V621은 2.4%, V622은 2.3% 및V623는 2.5% 수준으로 벡터에 따라서 큰 차이가 없이 항체결합 양성반응을 보여 주었 으며 (Table 1), 반면 비형질전환 세포의 경우 음성반응으로 나타났다 (Fig. 3). 또한 NPTII ELISA kit assay법에 의해 1차 선별을 통해 얻은 형질전환 캘러스 클론을 8주 이상 2주 간격으로 계대배양 하면서 선발배지에서 완전하게 적응된 캘러스 클론을 다시 선발하였다.
- 본 연구에서도 미숙배의 경우보다 type II배발생캘러스의 경우 증식 및유지가 매우 편리하였으며, 특히 계절적 요인으로 실험적 제한을 받지 않고 연속적인 실험을 수행할 수 있었다. 그뿐만 아니라 선발제로서 paromomycin이 첨가된 배지 에서 Agrobacterium과 공동배양된 type II 배발생캘러스 클론은 비 형질전환세포와 형질전환 세포 간에 뚜렷하게 구분되었으며, 특히 형질전환 가능성이 있는 클론의 경우 매우 빠른 생장속도를 보여 줌으로서 기 보고의 연구 결과와 일치되어 안정적으로 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 효과적인 방법으로 사료된다.
- 18%)를 각각 얻어 선발과정에서 많은 수의 클론이 도태되는 것으로 또한 알 수 있었다 (Table 1). 또한 각 벡터 별로 선발된 캘러스 클론으로부터 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, 이 중 약 125개체의 형질전환체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 Southern blot을 수행한 결과, pMVY613 벡터가 도입된 2개체와 V623이 도입된 2개체 에서 apxIIA유전자의 도입을 약한 밴드형태로 확인할 수 있었다 (Table 1, Fig. 4).
- 본 연구에서도 캘러스 클론의 선발과정에서 양성 대조군의 발현 정도와 비교 함으로서 형질전환 캘러스 클론을 비형질전환 캘러스 클론과 쉽게 구분 할 수 있는 효과적인 방법임을 알 수 있었지만, 이후 양성반응을 보인 캘러스를 8주 이상 배양할 경우 일부에서 증식되지 못하고 선발배지에서 도태되는 비율이 상당히 높게 나타나는 것으로 보아 항생제의 농도가 높아서 나타나는 현상인지 아니면 다른 요인에 의한 것인지 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 또한 선발된 각 캘러스 클론을 1차, 2차 및 발아배지 옮겨 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, pMYV611벡터를 제외 하고 모든 벡터에서 100개체 이상의 형질전환체를 얻을 수 있었다. 이중 Southern 분석을 통해 유전자 도입은 단지 4개체에서 확인 됨으로서 매우 낮은 빈도를 보여주었다.
- 2005). 본 연구에서도 미숙배의 경우보다 type II배발생캘러스의 경우 증식 및유지가 매우 편리하였으며, 특히 계절적 요인으로 실험적 제한을 받지 않고 연속적인 실험을 수행할 수 있었다. 그뿐만 아니라 선발제로서 paromomycin이 첨가된 배지 에서 Agrobacterium과 공동배양된 type II 배발생캘러스 클론은 비 형질전환세포와 형질전환 세포 간에 뚜렷하게 구분되었으며, 특히 형질전환 가능성이 있는 클론의 경우 매우 빠른 생장속도를 보여 줌으로서 기 보고의 연구 결과와 일치되어 안정적으로 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 효과적인 방법으로 사료된다.
- 이들 식물발현벡터는 paromomycin 항생제 저항 유전 자인 NPTII 선발마커와 표적 유전자로서 흉막폐렴균의 여러 가지 혈청을 생산하는 apxIIA유전자로 재조합하여 구축하였다. 식물발현벡터pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및V623의 경우 각각 4,120개, 5,959개, 7,581개, 52,329개, 48,948개 및 56,188개의 캘러스 클론을 Agrobacterium과 공동한 후 NPTII assay kit에 의해 nptII유전자의 발현빈도를 조사한 결과 각 벡터별로 2.3-4.4%의 캘러스 클론에서 항체결합 양성반응을 보였고, 이들 중 최종적으로 선발된 형질전환 캘러스 클론은 pMYV611에서 3개 (0.07%), pMYV613에서 4개 (0.07%), pMYV616에서 2개 (0.02%), V621에서 51개 (0.1%), V622에서 72개 (0.15%) 및 V623에서 102개 (0.18%)를 각각 얻었다. 형질전환된 캘러스 클론으로부터 재분화된 식물체에서 유전자 도입여부를 Southern 분석으로 통해 확인한 결과 pMYV613에서 2개 식물체 및 V623에서 얻은 2개 식물체에서 각각 확인되었다.
- 또한 선발된 각 캘러스 클론을 1차, 2차 및 발아배지 옮겨 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, pMYV611벡터를 제외 하고 모든 벡터에서 100개체 이상의 형질전환체를 얻을 수 있었다. 이중 Southern 분석을 통해 유전자 도입은 단지 4개체에서 확인 됨으로서 매우 낮은 빈도를 보여주었다. 이러한 결과는 Southern분석에 대한 실험 방법상의 문 제인 것으로 판단되어 형질전환체에 대한 분자 수준에서의 지속적인 분석을 수행하고 있다.
- 또한 NPTII ELISA kit assay법에 의해 1차 선별을 통해 얻은 형질전환 캘러스 클론을 8주 이상 2주 간격으로 계대배양 하면서 선발배지에서 완전하게 적응된 캘러스 클론을 다시 선발하였다. 최종적으로 pMYV611벡터에서 3개 캘러스 클론 (0.07%), pMYV61벡터에서 4개 (0.07%), pMYV616에서 2개 (0.03%), V621에서 51개 (0.1%), V622에서 72개 (0.15%) 및 V623에서 102개 (0.18%)를 각각 얻어 선발과정에서 많은 수의 클론이 도태되는 것으로 또한 알 수 있었다 (Table 1). 또한 각 벡터 별로 선발된 캘러스 클론으로부터 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, 이 중 약 125개체의 형질전환체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 Southern blot을 수행한 결과, pMVY613 벡터가 도입된 2개체와 V623이 도입된 2개체 에서 apxIIA유전자의 도입을 약한 밴드형태로 확인할 수 있었다 (Table 1, Fig.
- 18%)를 각각 얻었다. 형질전환된 캘러스 클론으로부터 재분화된 식물체에서 유전자 도입여부를 Southern 분석으로 통해 확인한 결과 pMYV613에서 2개 식물체 및 V623에서 얻은 2개 식물체에서 각각 확인되었다.
후속연구
- 2000). 본 연구에서도 캘러스 클론의 선발과정에서 양성 대조군의 발현 정도와 비교 함으로서 형질전환 캘러스 클론을 비형질전환 캘러스 클론과 쉽게 구분 할 수 있는 효과적인 방법임을 알 수 있었지만, 이후 양성반응을 보인 캘러스를 8주 이상 배양할 경우 일부에서 증식되지 못하고 선발배지에서 도태되는 비율이 상당히 높게 나타나는 것으로 보아 항생제의 농도가 높아서 나타나는 현상인지 아니면 다른 요인에 의한 것인지 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 또한 선발된 각 캘러스 클론을 1차, 2차 및 발아배지 옮겨 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, pMYV611벡터를 제외 하고 모든 벡터에서 100개체 이상의 형질전환체를 얻을 수 있었다.
- 이러한 결과는 Southern분석에 대한 실험 방법상의 문 제인 것으로 판단되어 형질전환체에 대한 분자 수준에서의 지속적인 분석을 수행하고 있다. 향후 본 연구를 통해 개발된 돼지 흉막폐렴 항원유전자가 도입된 옥수수 형질 전환체는 쥐와 돼지를 대상으로 임상실험을 수행하기 위하여 T 2 종자를 대량으로 증식하고 있다.
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