In this study, the antioxidative effects and inhibitory effects on tyrosinase and elastase of Sorbus commixta (S. commixta) twig extracts were investigated. The aglycone fraction of S. commixta twig extract showed the prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity(<...
In this study, the antioxidative effects and inhibitory effects on tyrosinase and elastase of Sorbus commixta (S. commixta) twig extracts were investigated. The aglycone fraction of S. commixta twig extract showed the prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity($FSC_{50}$, $13{\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities of S. commixta twig extracts on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were investigated by the luminol-dependent chemiluminescence assay. The 50 % ethanol extract among extracts showed the most prominent ROS scavenging activity ($OSC_{50}$, $0.189{\mu}g/mL$). The cellular protective effects of extract/fractions of S. commixta twig on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The 50 % ethanol extract and ethyl acetate fraction showed the cellular protective effects against ROS in a concentration dependent manner ($5{\sim}50{\mu}g/mL$). The inhibitory effect of S. commixta twig extract on tyrosinase was investigated to assess the whitening efficacy. The ethyl acetate ($IC_{50}$, $113.2{\mu}g/mL$) and aglycone fraction($IC_{50}$, $105.3{\mu}g/mL$) on tyrosinase showed more remarkable inhibitory effect than arbutin($IC_{50}$, $226.88{\mu}g/mL$), known as the whitening agent. The inhibitory effect of aglycone fraction ($IC_{50}$, $6.9{\mu}g/mL$) on elastase was simillar to quercetin($IC_{50}$, $6.1{\mu}g/mL$), flavonoid known as reference compound. These results indicate that extract/fractions of S. commixta twig can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. S. commixta twig extracts can be applicable to new functional cosmetics for anti-aging products.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory effects on tyrosinase and elastase of Sorbus commixta (S. commixta) twig extracts were investigated. The aglycone fraction of S. commixta twig extract showed the prominent free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activity($FSC_{50}$, $13{\mu}g/mL$). Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities of S. commixta twig extracts on ROS generated in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were investigated by the luminol-dependent chemiluminescence assay. The 50 % ethanol extract among extracts showed the most prominent ROS scavenging activity ($OSC_{50}$, $0.189{\mu}g/mL$). The cellular protective effects of extract/fractions of S. commixta twig on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were investigated. The 50 % ethanol extract and ethyl acetate fraction showed the cellular protective effects against ROS in a concentration dependent manner ($5{\sim}50{\mu}g/mL$). The inhibitory effect of S. commixta twig extract on tyrosinase was investigated to assess the whitening efficacy. The ethyl acetate ($IC_{50}$, $113.2{\mu}g/mL$) and aglycone fraction($IC_{50}$, $105.3{\mu}g/mL$) on tyrosinase showed more remarkable inhibitory effect than arbutin($IC_{50}$, $226.88{\mu}g/mL$), known as the whitening agent. The inhibitory effect of aglycone fraction ($IC_{50}$, $6.9{\mu}g/mL$) on elastase was simillar to quercetin($IC_{50}$, $6.1{\mu}g/mL$), flavonoid known as reference compound. These results indicate that extract/fractions of S. commixta twig can function as antioxidants in biological systems, particularly skin exposed to UV radiation by scavenging $^1O_2$ and other ROS, and protect cellular membranes against ROS. S. commixta twig extracts can be applicable to new functional cosmetics for anti-aging products.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 마가목 가지의 활용가치를 높이고자 이를 이용하여 피부노화 과정에 깊이 관여하여 활성산소인 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 항산화적 보호 작용과 각종 활성산소종 (H2O2, O2⋅-, ·OH 등)이 생성되는 계(Fe3+-EDTA/H2O2)에서의 활성산소에 대항한 총항산화능에 관한 연구를 진행하였다.
따라서 본 연구에서는 마가목 가지의 활용가치를 높이고자 이를 이용하여 피부노화 과정에 깊이 관여하여 활성산소인 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 항산화적 보호 작용과 각종 활성산소종 (H2O2, O2⋅-, ·OH 등)이 생성되는 계(Fe3+-EDTA/H2O2)에서의 활성산소에 대항한 총항산화능에 관한 연구를 진행하였다. 또한, 미백과 관련된 tyrosinase와 주름생성의 핵심적 효소인 elastase의 저해활성을 평가하여 마가목 가지 추출물의 기능성 화장품 원료로서의 응용 가능성을 확인 하고자하였다.
제안 방법
공시험군은 N-succinyl-(Ala)3-pnitroanilide가 용해된 완충용액 대신 0.12 M tris-Cl buffer 1,300 μL를 첨가하였으며, 농도는 실험군과 동일하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 다음 식에 의해 DPPH의 활성 저해율을 나타내었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5min 동안 항온 시킨 후 150 mM H2O2 40 μL를 넣고 화학발광을 25 min 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3․6H2O를 첨가하지 않은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다.
대조군은 시료대신 시료용액으로 사용된 용매를 100 μL 첨가하였다.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical [DPPH] 법은 피부노화의 원인으로 알려져 있는 free radical에 대하여 식물 추출물의 항산화 효능을 간단히 확인하기 위한 경우나 항산화화장품 원료들의 활성을 비교하기 위한 실험방법이다. 따라서 DPPH를 이용하여 마가목 가지 추출물의 free radical 소거활성을 측정하였다. 실험방법은 methanol에 용해시킨 0.
마가목 가지 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
추출물을 농도별로 각각 50 µL씩 첨가하고 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
대상 데이터
(+)-α-Tocopherol, L-ascorbic acid, arbutin, EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), luminol, 증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다.
FeCl3․6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4․2H2O, NaCl, 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), hexane 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-tyrosine과 N-succinyl-(Ala)3-pnitroanilthano, 효소로 사용된 tyrosinase (9.3 mg solid, 5,370 units/mg solid)와 elastase (4.5 mg protein/mL, 6.5 units/mg protein)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D (optical density)가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
실험에 사용한 마가목 가지는 2011년 3월 경동시장에서 구입하여 사용하였다. 건조된 마가목 가지 100 g을 잘게 자른 후 50 % 에탄올 2L를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하였다.
에틸아세테이트 분획으로부터 아글리콘 (aglycone) 분획 제조: 에틸아세테이트 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 에틸아세 테이트 가용분 일정량에 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류·냉각시킨다.
완충용액제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4․2H2O, NaCl, 그리고 ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetate (EtOAc), hexane 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student’s t-test를 행하였다.
Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 min까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4회 반복하여 평균하였다.
성능/효과
1. 마가목 가지 추출물의 free radical 소거능력(FSC50)은 50 % EtOH extract의 경우 33.10 µg/mL, 에틸아세테이트 분획의 경우 23.43 µg/mL, 에틸아세테이트 분획에서 당을 제거시킨 아글리콘의 경우 13.00µg/mL로 나타났다.
2. 마가목 가지 추출물의 활성산소 소거활성 (OSC50)은 50 % EtOH extract 분획에서 0.189 µg/mL, 에틸아세테이트 분획에서 0.35 µg/mL, aglycone 분획에서 0.23µg/mL로 나타났으며 이들 모두 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid(OSC50, 1.5µg/mL) 보다 우수한 활성산소 소거활성을 나타냈다.
3. 1O2으로 유도된 적혈구의 광용혈 현상에 있어서 마가목 가지 추출물중 50 % EtOH extract와 에틸아세테이트 분획은 농도 범위(5 ∼ 50 µg/mL)에서 농도-의존적으로 1O2으로 유도된 적혈구 세포의 용혈을 억제하였다.
4. 마가목 가지 추출물 중 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 tyrosinase 저해활성이 각각 113.20 µg/mL, 105.3 µg/mL으로 미백제인 arbutin (IC50, 226.9 µg/mL) 보다도 우수한 tyrosianse 저해 활성을 나타냈다.
5. 마가목 가지 추출물의 elastase 저해 활성은 에틸아세테이트 분획에서 48.90 µg/mL, 아글리콘 분획에서는 6.90 µg/mL으로 나타났으며 특히 아글리콘 분획은 elastase 활성 저해 효능이 우수한 quercetin(IC50, 6.10 µg/mL)과 유사한 효능을 나타내었다.
대조군(control)은 τ50이 32 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.
마가목 가지 추출물 중 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획의 경우에 tyrosinase 저해활성(IC50)이 각각 113.20 μg/mL, 105.3 μg/mL으로 비교 물질로 사용한 기능성 화장품의 미백제로 잘 알려진 arbutin의 저해 활성 226.88 μg/mL에 비해 더 높은 tyrosinase 저해활성을 보였다(Fig 5).
마가목 가지 추출물의 50 % EtOH extract 분획은 94.1 μg/mL, 에틸아세테이트 분획은 48.90 μg/mL 에서 elastase 저해활성(IC50) 을 나타내었고, 특히 아글리콘 분획은 6.90 μg/mL에서 비교물질로 사용한 강력한 항산화제이자 elastase 저해활성이 큰 것으로 알려진 quercetin (6.10 µg/mL)과 비슷한 elastase 저해 활성을 보였다(Fig 6).
마가목 가지의 아글리콘 분획은 5, 10, 25, 50 μg/mL의 농도 범위에서 τ50이 각각 101.60, 149.1, 277.5, 248.6 min으로 세포보호 효과를나타냈고, 농도가 50 μg/mL에서 감소하는 경향을 나타내었다.
아글리콘 분획의 free radical 소거 활성을 (+)-α-tocopherol과 비교했을 때 비슷한 소거활성을 나타내냄을 확인하였다.
특히, 아글리콘 분획(τ50, 149.10 min)은 10 µg/mL에서 지용성 항산화제인 (+)- α-tocopherol (τ50, 38.00 min) 보다 약 3 배 더 우수한 세포막 보호 활성을 나타내었다.
후속연구
이상의 결과들은 마가목 가지 추출물이 큰 항산화 활성을 나타내고, 주름개선 관련된 elastase 효소의 활성을 저해함으로써 마가목 가지 추출물의 화장품 응용 가능성이 큼을 시사한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마가목 가지에 함유된 성분으로 어떤 것들이 알려져 잇는가?
마가목 가지는 민간적으로 기침, 신경통, 천식, 기관지의 치료에 사용하거나 강장제로서 이용되었다[23-26]. 마가목 가지에 함유된 성분으로 catechin-7-Ο-β-D-xylopyranoside, catechin-7-Ο-β-D-apiofuranoside, prunasin, lupenone, lupeol 등이 알려져 있으며 혈중 알코올 농도를 유의성 있게 감소시키며 혈관계 염증성 질환 예방, 항동맥경화, 항염증 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.[27,28] 마가목의 활성 성분 중에서 catecch in-7 -Ο-β- D - x y l o p y r a n o s i d e 과 catechin-7-Ο-β-D-apiofuranoside은 강한 항산화 효과를 가진 성분이라고 보고하고 있다[28].
산화적 스트레스의 발생원인은 무엇인가?
피부는 다양한 환경적 요인(자외선, 공해, 산화제, 세균 등)에 빈번하게 접촉하고 있어서 산화적 스트레스에 민감하며 이는 피부 노화의 원인이 될 수 있다. 산화적 스트레스는 주원인이 태양 자외선 (UVA 및 UVB)에의 노출이며, 이는 자외선에 의해 생성된 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 피부에 존재하는 항산화제를 압도할 때 일어나는 현상이다. 활성산소종이란 반응성이 매우 큰 1O2 및⋅OH를 비롯하여 O2⋅- , H2O2, ROO⋅, RO⋅, ROOH 및 HOCl 등을 포함한다[1,2].
체내 활성산소종은 어떤 반응을 통해 생성될 수 있는가?
활성산소종이란 반응성이 매우 큰 1O2 및⋅OH를 비롯하여 O2⋅- , H2O2, ROO⋅, RO⋅, ROOH 및 HOCl 등을 포함한다[1,2]. 이들은 포르피린과 같은 광증감제에 의한 광증감 반응과 몇 가지 효소반응을 포함하는 다양한 과정을 거쳐서 세포 및 조직 중에서 생성될 수 있다[3]. 1O2 및 ⋅OH을 포함하는 활성산소는 DNA 산화, 결합조직 성분인 콜라겐, 히아루론산 등의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합에 의한 주름생성, 멜라닌 생성과정 등에 참여하는 등 피부노화를 가속시킨다[4-7].
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