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문제 정의
- 본 연구에서는 카놀라유(CO)와 대두극도경화유(FHSBO)를 기질로 TAG의 Sn-1,3 위치에 특이적으로 작용하는 lipozyme TLIM을 이용한 에스테르화 반응을 통해 저트랜스 고체지방에 적합한 재구성 지질을 합성 후 이화학적 특성을 살펴보았다.
가설 설정
- 3)Values are the means of two determinations with standard deviations.
제안 방법
- Carrier gas는 52.5 mL/min 유속의 N2를 사용하였고, injector 온도와 detector 온도는 각각 250℃와 260℃로 설정하였으며, 시료를 GC에 1 μL를 주입하여 split ratio 50:1로써 지방산 분석을 실행하였다.
- Column은 Nova-PakⓇC18 60Å 4 μm(3.9×150 mm i.d., Waters, Milford, Ireland)을 사용하였고 Younglin SP930D dual pump(Seoul, Korea)를 이용하여 분석을 실행하였다.
- Thin-layer chromatography(TLC, 20×20 cm, Merck, Damstadt, Germany)에 의하여 탈산과정을 거치기 전 시료의 TAG 부분만 획득하여 methylation을 실시하였다.
- 적정이 끝난 후에 70～80℃의 뜨거운 물로 비누화된 물질을 제거하기 위하여 물층이 맑아질 때까지 수세하였다. nhexane과 ethanol을 첨가하여 유지층과 물층이 완전히 분리되도록 충분히 정치시키고 sodium sulfate에 상층액인 hexane층을 통과시켜 수분 및 불순물을 제거하였다. 이를 질소가스로 용매를 완전히 제거하고 남은 저트랜스 고체지방의 이화학적 특성을 살펴보았다.
- 시료가 열을 방출하거나 흡수함으로써 얻어지는 열량변화로부터 유지의 결정화 곡선(crystallization point)과 용융 곡선(melting point) 및 고체지방 함량(solid fat content, SFC) 등의 물리화학적 변화를 알아보기 위하여 DSC(model DSC 2010, TA Instruments, New Castle, DE, USA)로 분석하였다. 각 분석시료는 약 5～10 mg을 취하여 분석하였고 cell은 aluminum pan을 사용하였으며, 검량선 작성을 위한 표준품으로는 공시료를 통한 분석결과를 이용하였다. Thermogram을 얻기 위해 80℃에서 10분 동안 유지한 후 분당 10℃의 비율로 -60℃까지 냉각하여 10분 동안 유지한다음 다시 80℃까지 분당 5℃의 비율로 온도를 높였다.
- 효소적 합성에 의한 저트랜스 고체지방 내 TAG 조성 분석을 위하여 RP-HPLC 분석을 실시하였다. 검출기는 Sedex 75 evaporative light scattering detector(ELSD, Dedere, Alfortvill, France)를 사용하였고 50℃, 1.7 bar로 설정하였다. Column은 Nova-PakⓇC18 60Å 4 μm(3.
- 합성기질로서의 카놀라유(CO)와 대두극도경화유(FHSBO)를 각각 질량비를 달리하여(CO:FHSBO＝70:30, 75:25, 80:20) 저트랜스 고체지방의 합성에 사용하였다. 기질을 충분히 교반한 후 총 기질 무게의 20%의 Lipozyme TLIM을 넣어 반응하였다. 반응은 shaking water bath에서 이루어졌으며 70℃, 220 rpm의 조건에서 수행하였다.
- 반응 시작 후 1시간과 3, 6, 18, 24시간마다 시료를 채취하여 PTFE syringe filter(0.5 μm, Advantec Co., Tokyo, Japan)에 넣고 여과하여 보관하였다.
- 각각의 반응물을 구성하는 지방산들의 길이 및 불포화도에 따라 PN(partition number)으로 분리하여 분석한 결과, PN 44～54 범위에 다양한 TAG 조성들이 분포되어 있음을 알 수 있었다. 반응물의 주요 TAG조성은 LOO, OOO, POO/SOL, SOO, SOS(O＝oleic acid, P＝palmitic acid, S＝stearic acid, L＝linoleic acid, Ln＝linolenic acid)이며, 각 기질이 가지고 있는 지방산 비율에 따라 차별적인 결과를 보여주었다. 불포화지방산이 많은 카놀라유의 함량이 많아질수록, PN=46의 LOO는 6.
- 반응에 사용된 기질인 카놀라유와 대두극도경화유 및 세 혼합 비율(CO : FHSBO＝70:30, 75:25, 80:20)로 합성된 저트랜스 고체지방의 용융곡선 및 결정화 곡선을 분석하였다(Fig. 1). 상온에서 액체인 카놀라유와 고체인 대두극도경화 유의 용융곡선은 각각 -15.
- 그 다음, 2 mL의 isooctane과 1 mL의 포화 NaCl 용액을 첨가하여 충분히 혼합 후 두 층으로 분리되도록 정치하였다. 분리된 상층만 취하여 sodium sulfate column에 통과시켜 수분을 제거한 후 지방산 조성 분석을 하였다. 분석 시 GC(Hewlett-Packard 6890 series, Avondale, PA, USA)를 사용하였고, column은 SPTM-2560(100 m×0.
- 시료가 열을 방출하거나 흡수함으로써 얻어지는 열량변화로부터 유지의 결정화 곡선(crystallization point)과 용융 곡선(melting point) 및 고체지방 함량(solid fat content, SFC) 등의 물리화학적 변화를 알아보기 위하여 DSC(model DSC 2010, TA Instruments, New Castle, DE, USA)로 분석하였다. 각 분석시료는 약 5～10 mg을 취하여 분석하였고 cell은 aluminum pan을 사용하였으며, 검량선 작성을 위한 표준품으로는 공시료를 통한 분석결과를 이용하였다.
- , Tokyo, Japan)에 넣고 여과하여 보관하였다. 유지의 탈산은 저트랜스 고체지방에 0.5 N 페놀프탈레인 지시약을 3～4방울 떨어뜨린 후 2 N KOH 에탄올 용액으로 종말점인 분홍색이 될 때까지 적정하였다. 적정이 끝난 후에 70～80℃의 뜨거운 물로 비누화된 물질을 제거하기 위하여 물층이 맑아질 때까지 수세하였다.
- nhexane과 ethanol을 첨가하여 유지층과 물층이 완전히 분리되도록 충분히 정치시키고 sodium sulfate에 상층액인 hexane층을 통과시켜 수분 및 불순물을 제거하였다. 이를 질소가스로 용매를 완전히 제거하고 남은 저트랜스 고체지방의 이화학적 특성을 살펴보았다.
- 저트랜스 고체지방의 Sn-1,3과 Sn-2의 위치별 지방산 조성 분석을 위하여 pancreatic lipase에 의한 가수분해를 실행하였다. 약 7 mg의 시료에 7 mL의 1 M Tris-HCl buffer(pH 7.
- 저트랜스 고체지방의 지방산 조성 분석을 위하여 methylation을 한 후 gas chromatograph(GC) 분석을 실시하였다. Thin-layer chromatography(TLC, 20×20 cm, Merck, Damstadt, Germany)에 의하여 탈산과정을 거치기 전 시료의 TAG 부분만 획득하여 methylation을 실시하였다.
- 전개용매는 n-hexane : diethyl ether : acetic acid＝50:50:1(v/v/v)을 사용하여 TLC(20×20 cm, Merck) 분석을 실시하였으며, 2-monoacylglycerol(MAG) band를 분리한 후 GC 분석을 수행하였다.
- 합성에 사용된 기질인 카놀라유와 대두극도경화유의 지방산 조성을 분석하였다(Table 2). 카놀라유는 oleic acid(C18:1, 60.
- 효소적 합성에 의한 저트랜스 고체지방 내 TAG 조성 분석을 위하여 RP-HPLC 분석을 실시하였다. 검출기는 Sedex 75 evaporative light scattering detector(ELSD, Dedere, Alfortvill, France)를 사용하였고 50℃, 1.
- 효소합성에 사용된 기질인 카놀라유와 대두극도경화유를 사용하여 다양한 혼합비율로 생성된 반응물의 TAG조성을 역상 HPLC를 통하여 분석하였다(Fig. 3). 각각의 반응물을 구성하는 지방산들의 길이 및 불포화도에 따라 PN(partition number)으로 분리하여 분석한 결과, PN 44～54 범위에 다양한 TAG 조성들이 분포되어 있음을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 기질합성에 사용한 고정화 효소인 Lipozyme TLIM(Thermomyces lanuginosus)은 Novozymes Co.(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하였다. 또한, 지방산 분석에 사용된 10% BF3-methanol은 Supelco(Bellefonte, PA, USA)에서 구입하였으며, 유지의 Sn-2 position의 지방산 조성을 분석하기 위해 사용된 pancreatic lipase(Type Ⅱ, crude)는 SigmaAldrich Chemical Co.
- 본 실험에 사용된 카놀라유는 C사(Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, 대두극도경화유는 C.J. Co(Seoul, Korea)에서 제공받아 저트랜스 고체지방 합성에 사용하였다. 기질합성에 사용한 고정화 효소인 Lipozyme TLIM(Thermomyces lanuginosus)은 Novozymes Co.
- )로 여과 후 20μL 주입하였다. 분석에 사용된 용매는 acetonitrile(A)과 isopropanol(B) : hexane＝2:1(v/v)의 기울기용리였으며, 유속은 1 mL/min로 흘려주었다. TAG의 partition number (PN)는 아래의 계산식에 의해 구하였다.
-
저트랜스 고체지방의 효소적 합성
합성기질로서의 카놀라유(CO)와 대두극도경화유(FHSBO)를 각각 질량비를 달리하여(CO:FHSBO＝70:30, 75:25, 80:20) 저트랜스 고체지방의 합성에 사용하였다. 기질을 충분히 교반한 후 총 기질 무게의 20%의 Lipozyme TLIM을 넣어 반응하였다.
데이터처리
- 5 mL/min 유속의 N2를 사용하였고, injector 온도와 detector 온도는 각각 250℃와 260℃로 설정하였으며, 시료를 GC에 1 μL를 주입하여 split ratio 50:1로써 지방산 분석을 실행하였다. 한편, GC-FID 상에서의 분석은 각 지방산의 메틸에스테르이므로 해당 지방산으로 전환하기 위하여 각 지방산 별 전환계수는 식약청에서 제시한 표(16)와 계산식을 이용하였고 분석은 두 반복씩 실시하여 평균값을 구하였다.
이론/모형
- 전개용매는 n-hexane : diethyl ether : acetic acid＝50:50:1(v/v/v)을 사용하여 TLC(20×20 cm, Merck) 분석을 실시하였으며, 2-monoacylglycerol(MAG) band를 분리한 후 GC 분석을 수행하였다. 한편, Sn-1,3 조성 계산은 아래와 같이 Fomuso와 Akoh(17)의 계산식을 이용하여 구하였다.
성능/효과
- 3). 각각의 반응물을 구성하는 지방산들의 길이 및 불포화도에 따라 PN(partition number)으로 분리하여 분석한 결과, PN 44～54 범위에 다양한 TAG 조성들이 분포되어 있음을 알 수 있었다. 반응물의 주요 TAG조성은 LOO, OOO, POO/SOL, SOO, SOS(O＝oleic acid, P＝palmitic acid, S＝stearic acid, L＝linoleic acid, Ln＝linolenic acid)이며, 각 기질이 가지고 있는 지방산 비율에 따라 차별적인 결과를 보여주었다.
- 회분식 반응기에 의하여 합성된 다양한 혼합비율의 저트랜스 고체지방의 반응에 사용된 기질의 SFC를 Table 1에 나타내었다. 기질의 SFC를 분석한 결과, 상온에서 액체 상태인 카놀라유는 0℃에서, 고체상태인 대두극도경화유는 75℃에서 완전히 융해되는 것을 확인할 수 있었다. 반응 비율에 따른 SFC를 측정한 결과, 다양한 SFC 함량을 나타내었으며 액체유지인 카놀라유의 비율이 높아질수록 각 온도에 해당하는 SFC는 감소하였다.
- 대두극도경화유의 함량이 가장 많은 70:30의 총 포화지방산(∑SFA)은 다른 비율에 비해 36.3 wt%로 가장 높게 측정되었고, 총 불포화지방산(∑USFA)은 63.5 wt%로 가장 낮게 측정되었다.
- 본 연구결과에 의하면 카놀라유와 대두 극도경화유를 70:30의 혼합비율로 효소적 에스테르교환 반응을 한 것을 제외한 나머지 저트랜스 고체지방은 10℃에서 바름성이 좋을 것으로 사료된다. 또한, 70:30, 75:25, 80:20의 혼합비율로 에스테르 교환한 것 모두 냉장이 필요하며 입에서 부드럽게 녹는 구용성도 좋을 것으로 판단되었다.
- 전체적으로 카놀라유의 함량이 높아질수록 흡열 곡선의 피크가 융점이 낮은 쪽으로 이동하는 것을 볼 수 있었다. 반면, 결정화 곡선에서도 세 개의 저트랜스 고체지방 모두 세 개의 피크(peak)를 나타내었으며 70:30의 비율로 반응된 저트랜스 고체지방의 경우 -39.2℃, 4.7℃ 및 19.5℃에서, 75:25는 -44.9℃, 0.2℃ 및 13.9℃에서, 그리고 80:20의 경우 -41.5℃, -1.7℃ 및 10.2℃에서 피크들이 보였으며, 용융 곡선과 마찬가지로 카놀라유의 함량이 높아지면서 피크의 온도가 낮은 쪽으로 이동하는 경향, 즉 결정화 온도가 점차 낮아지는 경향을 보였다(Fig. 2B).
- 4%로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 포화지방산이 많은 대두극도경화유의 함량이 줄어들수록, PN=50의 POS/PSP가 9.6%에서 5.1%, PN=52의 SOS는 11.0%에서 5.1%로 줄어들었고, PN=54의 SSS의 함량은 줄어들다가 80:20에서는 발견되지 않은 것을 확인할 수 있었다(Table 7).
- 기질의 SFC를 분석한 결과, 상온에서 액체 상태인 카놀라유는 0℃에서, 고체상태인 대두극도경화유는 75℃에서 완전히 융해되는 것을 확인할 수 있었다. 반응 비율에 따른 SFC를 측정한 결과, 다양한 SFC 함량을 나타내었으며 액체유지인 카놀라유의 비율이 높아질수록 각 온도에 해당하는 SFC는 감소하였다. 또한, 80:20의 합성 비율을 제외한 나머지 시료들은 45℃에서 완전히 융해되는 것으로 나타났다.
- 한편, 다양한 비율로 혼합된 저트랜스 고체지방들의 반응 시간에 따른 지방산 조성을 분석한 결과(Table 3～5), 전반적으로 stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1), linoleic acid(C18:2)가 주요 지방산들로서 전체 지방산의 80% 이상을 차지하고 있음을 알 수 있었다. 본 실험에서의 여러 반응조건(기질비율별 및 반응시간별)들에 따른 저트랜스 고체지방들의 지방산의 함량은 C18:0이 17.6～27.0 wt%, C18:1이 44.6～50.9 wt%, C18:2는 12.4～16.7 wt%의 함량을 나타내었다. 혼합 비율별로 카놀라유의 함량이 많아질수록 C18:1의 함량이 증가되었고, 대두극도경화유가 많아질수록 C18:0의 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있었는데, 각각의 기질이 차지하는 비율에 따른 것이라 사료된다.
- 5%이면 냉장할 필요가 없는 것으로 보고되어 있다(21). 본 연구결과에 의하면 카놀라유와 대두 극도경화유를 70:30의 혼합비율로 효소적 에스테르교환 반응을 한 것을 제외한 나머지 저트랜스 고체지방은 10℃에서 바름성이 좋을 것으로 사료된다. 또한, 70:30, 75:25, 80:20의 혼합비율로 에스테르 교환한 것 모두 냉장이 필요하며 입에서 부드럽게 녹는 구용성도 좋을 것으로 판단되었다.
- 반응물의 주요 TAG조성은 LOO, OOO, POO/SOL, SOO, SOS(O＝oleic acid, P＝palmitic acid, S＝stearic acid, L＝linoleic acid, Ln＝linolenic acid)이며, 각 기질이 가지고 있는 지방산 비율에 따라 차별적인 결과를 보여주었다. 불포화지방산이 많은 카놀라유의 함량이 많아질수록, PN=46의 LOO는 6.8에서 10.1%로 증가하였고, PN=48의 OOO는 8.9에서 19.9%, POO/SOL은 21.8%에서 23.2%로 증가하였으며, PN=50의 SOO는 24.9에서 28.4%로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 포화지방산이 많은 대두극도경화유의 함량이 줄어들수록, PN=50의 POS/PSP가 9.
- 2A). 전체적으로 카놀라유의 함량이 높아질수록 흡열 곡선의 피크가 융점이 낮은 쪽으로 이동하는 것을 볼 수 있었다. 반면, 결정화 곡선에서도 세 개의 저트랜스 고체지방 모두 세 개의 피크(peak)를 나타내었으며 70:30의 비율로 반응된 저트랜스 고체지방의 경우 -39.
- 합성에 사용된 기질인 카놀라유와 대두극도경화유의 지방산 조성을 분석하였다(Table 2). 카놀라유는 oleic acid(C18:1, 60.4 wt%), linoleic acid(C18:2, 22.7 wt%), linolenic acid(C18:3, 7.4 wt %)가 주요 지방산으로 확인되었고, 대두극도 경화유는 palmitic acid(C16:0, 14.1 wt%), stearic acid(C18:0, 79.9 wt%)가 주로 차지하였다. 위치별 지방산 조성의 경우 sn-2 position에서 카놀라유는 C18:1과 C18:2의 함량이 각각 58.
- Table 6은 최종 24 hr 반응한 저트랜스 고체지방들의 Sn-2 position을 나타낸 것이다. 카놀라유와 대두극도경화유의 혼합 비율이 70:30, 75:25, 80:20에 대한 Sn-2 position은 stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1), linoleic acid(C18:2)가 주요 지방산으로 카놀라유의 함량이 높아질수록 C18:1과 C18:2 등의 불포화지방산이 점점 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 트랜스 지방산 함량은 0.
- 한편, 다양한 비율로 혼합된 저트랜스 고체지방들의 반응 시간에 따른 지방산 조성을 분석한 결과(Table 3～5), 전반적으로 stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1), linoleic acid(C18:2)가 주요 지방산들로서 전체 지방산의 80% 이상을 차지하고 있음을 알 수 있었다. 본 실험에서의 여러 반응조건(기질비율별 및 반응시간별)들에 따른 저트랜스 고체지방들의 지방산의 함량은 C18:0이 17.
- 7 wt%의 함량을 나타내었다. 혼합 비율별로 카놀라유의 함량이 많아질수록 C18:1의 함량이 증가되었고, 대두극도경화유가 많아질수록 C18:0의 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있었는데, 각각의 기질이 차지하는 비율에 따른 것이라 사료된다. 대두극도경화유의 함량이 가장 많은 70:30의 총 포화지방산(∑SFA)은 다른 비율에 비해 36.
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