[논문]마우스대식세포주인 RAW 264.7에서 SD-01의 항염증 활성 연구

박선동

doi:10.6116/kjh.2010.25.3.019

마우스대식세포주인 RAW 264.7에서 SD-01의 항염증 활성 연구
Anti-inflammatory effect of SD-01 in RAW 264.7 cells 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.25 no.3, 2010년, pp.19 - 25

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : The aim of this study was to investigate anti-inflammatory activity of SD-01 methanol extract in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. Methods : Cytotoxic activity of SD-01 methanol extract on RAW 264.7 cells was measured using 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) assay. The nitric oxide (NO) production was measured by Griess reagent system. And proinflammatory cytokines and $PGE_2$ were measured by ELISA method. The levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), $I{\kappa}$-B-alpha and nuclear NF-${\kappa}$ B p65 expression were detected by western blot. Results : Our results indicated that methanol extract of SD-01 significantly inhibited the LPS-induced NO, $PGE_2$ production and iNOS, COX-2 expression accompanied by an attenuation of TNF-$\alpha$, IL-$1\beta$, IL-6 and MCP-1 production in RAW 264.7 cells. Moreover, methanol extract of SD-01 treatment also blocked LPS-induced NF-kB activation. Conclusion : These findings indicate that methanol extract of SD-01 inhibits the production of pro-inflammatory mediators and cytokines via suppression of NF-${\kappa}$ B activation. Take together, these results indicate that methanol extract of SD-01 has the potential for use as an agent of anti-chronic inflammatory diseases.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구실에서는 이러한 기조를 바탕으로 전통적인 한약으로부터 신약개발의 가능성을 탐색하고 있다. 과학적 입증이 전제된 몇 가지 전통 한약으로 복합처방을 구성하여 그 유효성을 밝혀 보고자 한다.
대식세포에서 LPS에 의해서 활성화되는 NF-κB의 주요 구성요소는 p65 이기 때문에, western blot을 통해 SD-01 추출물이 p65의 활성에 미치는 영향과 IκB-α의 phosphorylation에 미치는 영향을 확인해 보았다.
본 처방도 가장 전통적이면서 과학적 관점에서 항염증작용이 우수할 것으로 기대되는 것임을 고려하여 가장 적합한 조성과 비율로 설정되었다. 따라서 다양한 염증 관련 질환의 예방과 치료를 목표로 한 본 처방의 항염증효과를 확인하고자 한다.
본 연구실에서는 이러한 기조를 바탕으로 전통적인 한약으로부터 신약개발의 가능성을 탐색하고 있다. 과학적 입증이 전제된 몇 가지 전통 한약으로 복합처방을 구성하여 그 유효성을 밝혀 보고자 한다.
본 연구에서는 SD-01 처방의 활성 산소종(ROS)과 활성 질소종 (RNS)의 생성억제를 통한 항산화 활성을 조사하고, 항염증 활성을 조사하기 위하여 마우스 대식세포인 RAW 264.7에 염증유도물질인 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 생성되는 염증성 물질 및 그 활성화 기전에 미치는 영향을 조사한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

PBS로 2회 washing한 다음 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광강도의 증가율은 대조군과 비교해서 배수 (fold)로 계산하였다.
7 세포를 분주하고 약재를 농도별로 18 시간 동안 처리한 후, Well당 20 ㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. Microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 약재가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System⁹⁾을 이용하여 측정하였다. RAW 264.
배양 후, 10 μM DCFH-DA를 45분간 처리하였다. PBS로 2회 washing한 다음 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광강도의 증가율은 대조군과 비교해서 배수 (fold)로 계산하였다.
RAW 264.7 세포에 약재를 100, 200 μg/ml의 농도로 18시간 동안 처리한 후 100 ng/ml의 LPS를 1시간 동안 처리하여 NF-κB p65의 핵으로의 translocation에 미치는 영향을 nuclear extraction를 수행하여 세포의 핵과 세포질을 분리한 다음 핵내로 이동한 NF-κB p65과 세포질내의 인산화된 IκB-α (p-IκB-α)의 양을 조사하였다.
RAW 264.7 세포에 약재를 100, 200 μg/ml의 농도로 1시간 동안 전 처리한 후 100 ng/ml LPS를 18시간 동안 처리하여 LPS에 의해 유도되는 IL-6, TNF-α, IL-1β, MCP-1의 생성량에 미치는 영향을 조사하였다.
RAW 264.7 세포에서 SD-01 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS를 처리하여 염증을 유발한 다음 SD-01추출물에 의해 염증인자인 NO, PGE2와 iNOS, COX-2 발현, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1의 생성에 미치는 영향을 살펴보았다.
SD-01 추출물이 LPS에 의한 RAW 264.7 세포 내의 ROS 생성에 미치는 효과를 DCF-DA assay를 통하여 검토하였다. 먼저 RAW 264.
배양액 50 ㎕와 같은 양의 Griess Reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 계산하였다.
이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
따라서 RAW 264.7 세포에서 SD-01 추출물이 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-1β, MCP-1의 생성량에 미치는 영향을 알아보았다.
의 생성량을 ELISA assay를 수행하였다. 또한 western blotting을 통해 NO의 생성효소인 iNOS와 PGE₂의 생성효소인 COX-2의 발현정도를 조사하였다. 그 결과 100 ng/ml의 LPS에 의해 NO와 PGE₂의 생성량이 각각 11배, 9.
마우스 대식세포인 RAW 264.7에 대한 SD-01 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. SD-01 추출물을 농도별 (0, 10, 100, 200, 300, 400, 500 μg/ml)로 18시간 동안 처리한 결과, 100 μg/ml의 농도까지는 세포의 생존율이 90% 이상으로 독성이 거의 나타나지 않았고 200 μg/ml의 농도에서 75%의 생존율을 나타내었다.
먼저 RAW 264.7 세포에 100, 200 μg/ml의 SD-01 추출물을 전처리한 다음, LPS로 세포 내의 ROS 생성을 유도하여 DCF 형광강도를 관찰하였다.
Microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다. 약재가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
염증성 매개물질의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Griess Reagent를 사용하여 NO의 생성량을 조사하였고 PGE₂의 생성량을 ELISA assay를 수행하였다. 또한 western blotting을 통해 NO의 생성효소인 iNOS와 PGE₂의 생성효소인 COX-2의 발현정도를 조사하였다.
1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
이와 같이 SD-01 처방을 구성하는 약재들의 활성에 기인하여, SD-01 처방의 항산화 및 항염증 활성이 뛰어날 것으로 생각되어 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에서의 항염증 활성 실험을 진행하였다.

대상 데이터

Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였고, 각종 사이토카인 측정을 위한 ELISA kit와 Nuclear and cytoplasmic protein extraction reagents는 Pierce Biotechnology사(Rockford, USA)에서 구입하였으며, PGE2 assay kit는 R&D사 (Minneapolis, USA)에서 구입하였다.
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit와 Griess Reagent System은 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였고, 각종 사이토카인 측정을 위한 ELISA kit와 Nuclear and cytoplasmic protein extraction reagents는 Pierce Biotechnology사(Rockford, USA)에서 구입하였으며, PGE₂ assay kit는 R&D사 (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. Protein assay reagent는 Bio-Rad사 (Hercules, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급이상으로 사용하였다.
을 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포에 SD-01 추출물을 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 LPS를 18시간 처리한 후 배양액을 수거하여 실험에 사용하였다. 배양액 50 ㎕와 같은 양의 Griess Reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였다.
본 실험에 사용한 약재는 동국대학교 한의과대학 방제학교실에서 선별된 것을 정선하여 사용하였으며, SD-01 처방에 사용된 약재의 구성과 함량은 Table 1과 같다. 약재에 3배량의 메탄올을 가한 다음 70℃에서 48시간 동안 추출하여 여과한 후 농축하고 동결 건조하여 50.
세포 배양액 내의 PGE2 양을 측정하기 위해 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems (Minneapolis, USA)에서 구입하여 실험하였다.
세포에 SD-01 추출물을 처리하고 1시간 후 100 ng/ml의 LPS를 18시간 처리하였다. 세포 배양액을 얻어 사이토카인 측정에 이용하였다. 배양액을 적절한 농도로 희석한 후, 사이토카인으로 coating된 96 well plate에 50 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 overnight시켰다.
세포 배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 1차 항체인 iNOS antibody와 2차 항체인 anti-rabbit and anti-mouse IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, USA)에서, COX-2, p-IκB-α, NF-κB와 β-actin antibody는 Cell Signaling Technology사 (Beverly, USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 시약 중 Sodium Dodesyl Sulfate (SDS), Acrylamide, Bis는 Bio-Rad사 (Hercules, USA)에서 구입하였고, 1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl (DPPH), EDTA, hypoxanthine, lipopolysaccharide (LPS), 4,5-diaminofluorecein (DAF-2), 6-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH -DA), CAPS, tween 20, protease inhibitors 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

결과는 means±SEM으로 나타내었으며, 통계분석법은 GraphPad Prism 4.0을 이용하여 one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range tests를 실시한 후, P값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.

이론/모형

SD-01 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) assay 방법⁶⁾으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것이다.
SD-01 추출물이 LPS에 의한 RAW 264.7 세포의 산화적 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCFH-DA assay를 실시하였다^7,8). 먼저 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 24시간 배양 후, 약재를 농도별로 1시간 전처리하고 100 ng/ml의 LPS를 18시간 동안 처리하였다.
세포 배양액 내의 cytokines의 양을 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)를 수행하였다. 세포에 SD-01 추출물을 처리하고 1시간 후 100 ng/ml의 LPS를 18시간 처리하였다.

성능/효과

IL-1β는 79.1%, 96.5% 감소되었으며, MCP-1은 63.9%, 67.2% 감소되었다.
LPS 처리에 의해 각각 63.7배, 87.7배, 109.3배, 4.1배 생성량이 증가하였고, IL-6는 SD-01 100, 200 μg/ml의 농도에서 48.4%, 93% 감소되었고, TNF-α는 41.5%, 84.3% 감소되었다.
3A). LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2의 발현량 또한 SD-01 추출물에 의해 농도의존적인 감소효과를 확인하였다 (Fig. 3B).
ROS 생성효소인 NADPH oxidase의 inhibitor인 AEBSF을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-6, TNF-α, IL-1β, MCP-1의 생성이 효과적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
SD-01 추출물은 대식세포인 RAW 264.7 내에서 LPS 자극으로 발생한 ROS의 생성을 유의성 있게 감소시켰으며, NF-κB의 활성화를 저해를 통해 염증성 물질들의 생성 또한 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
SD-01 추출물을 농도별 (0, 10, 100, 200, 300, 400, 500 μg/ml)로 18시간 동안 처리한 결과, 100 μg/ml의 농도까지는 세포의 생존율이 90% 이상으로 독성이 거의 나타나지 않았고 200 μg/ml의 농도에서 75%의 생존율을 나타내었다.
그 결과 100 ng/ml의 LPS에 의해 NO와 PGE2의 생성량이 각각 11배, 9.2배 증가하였고, 증가된 NO는 100, 200 μg/ml의 SD-01 추출물에 의해 48.4%, 56.3%까지 생성량이 감소하였고, PGE2는 33.8%, 40.5%까지 감소되는 것으로 나타났다 (Fig. 3A).
그 결과, LPS 처리에 의해 핵내로 이동한 NF-κB p65의 양이 크게 증가하였고 이는 SD-01 추출물에 의해 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다 (Fig. 5A).
7 세포에서 SD-01 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS를 처리하여 염증을 유발한 다음 SD-01추출물에 의해 염증인자인 NO, PGE₂와 iNOS, COX-2 발현, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1의 생성에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, SD-01 추출물은 LPS로 유도된 염증 인자들과 생성효소의 발현, 그리고 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
7 세포에 100, 200 μg/ml의 SD-01 추출물을 전처리한 다음, LPS로 세포 내의 ROS 생성을 유도하여 DCF 형광강도를 관찰하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 LPS를 처리한 실험군에서는 유의성 있는 형광강도의 증가 (1.8배)를 보였다. 이로써 LPS의 처리가 RAW 264.
또한 cytosol extract에서 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 phosphorylation이 SD-01 추출물에 의해 농도 의존적으로 저해됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 5B).
먼저, DCFH-DA assay를 수행하여 SD-01추출물이 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 내의 ROS 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, LPS에 의해 세포내 ROS의 생성이 약 1.8배 증가하였고 SD-01 추출물에 의해 효과적으로 감소되는 것을 확인하였다.
대부분의 다양한 질병은 염증기작을 전제로 변화되어지는 경향이 있기 때문이다. 본 처방도 가장 전통적이면서 과학적 관점에서 항염증작용이 우수할 것으로 기대되는 것임을 고려하여 가장 적합한 조성과 비율로 설정되었다. 따라서 다양한 염증 관련 질환의 예방과 치료를 목표로 한 본 처방의 항염증효과를 확인하고자 한다.
8배)를 보였다. 이로써 LPS의 처리가 RAW 264.7 세포 내의 ROS 생성을 효과적으로 유도하였음을 알 수 있었다. 이는 SD-01 추출물의 농도 100, 200 μg/ml을 함께 처리한 경우 각각 63.
7 내에서 LPS 자극으로 발생한 ROS의 생성을 유의성 있게 감소시켰으며, NF-κB의 활성화를 저해를 통해 염증성 물질들의 생성 또한 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이상의 결과들로 보아, SD-01의 메탄올 추출물은 뛰어난 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 SD-01은 동맥경화, 관절염, 고혈압, 암, 당뇨, 천식 등의 만성 염증성 질환 치료에 효과적으로 응용해 볼 가치가 있을 것으로 생각된다.

후속연구

이상의 결과들로 보아, SD-01의 메탄올 추출물은 뛰어난 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 SD-01은 동맥경화, 관절염, 고혈압, 암, 당뇨, 천식 등의 만성 염증성 질환 치료에 효과적으로 응용해 볼 가치가 있을 것으로 생각된다.
현재 한약의 복합기전을 밝혀내는 분석방법은 미약한 수준이다. 이 한약의 복합화합물에 의한 복합기전이 밝혀져야 한의학의 과학적 입증 및 신약개발을 위한 기초적인 자료가 축적될 것이다¹²⁾.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증반응의 만성화에 의해 유발되는 질환은?	반복적인 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면 염증관련 세포에서 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)과 활성 질소종 (reactive nitrogen species, RNS)이 과다 생성됨으로써 염증성 관련 질환이 유발된다1). 류마티스 관절염, 동맥경화증, 위염, 천식 등이 염증반응의 만성화에 의해 유발되는 질환이다2).
	천연약물에서 신약을 찾기 시작한 배경이 된 화학합성물을 이용한 신약개발의 어려움은?	신약개발은 전형적인 지식기반 연구개발로 고부가가치를 창출하는 21세기형 산업이다. 그러나 화학합성물로부터 신약개발은 신물질에서 허가까지 평균 14.9년이 걸리며, 성공률 또한 낮으며, 개발비용은 날로 높아지고 있다. 따라서 최근에 이러한 어려움의 돌파구로 신약연구부문에서는 천연약물 (한약)에서 신약을 찾기 시작했고, 이에 대한 특허 건수도 꾸준히 증가하고 있다15).
	ROS의 역할은?	ROS는 다양한 세포 스트레스 메커니즘에 관여하고 있고 염증반응에 관련된 메카니즘인 nuclear factor-kappa B (NF-κB)의 활성을 조절한다는 보고도 있다3). 실제로 뛰어난 항산화 물질이 NF-κB의 활성을 억제하고4), 세포 내의 ROS 생성을 감소시킨다는5) 보고가 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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