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문제 정의
- 분석결과 형질전환계통 내 인산과 질소간 불균형이 간장과 이삭목 추출도 등에 영향을 미친 것으로 생각되었다. 따라서 질소시비의 조절로 형질전환계통의 정상 간장을 확보할 수 있을 것으로 보고 질소시비시험을 수행하였다. 2007년 포장시험 중 질소비료의 함량을 2배로 늘린 (2N)P시험 구에서 OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통의 간장이 각각 6, 4cm 증가한 반면 동진, OsPT7-OX과 OsPT8-OX은 오히려 간장이 줄어들었다(Fig.
- OsPT4-OX 후대에서 분리된 단간, 중간과 장간종은 각기 OsPT4/OsPT4, OsPT4/-과 -/-(동진벼 wild type)으로, 식물체 내 OsPT4의 발현량에 따라 과도한 인산집적으로 각 계통이 간장과 이삭목 추출도가 분리되는 것으로 생각되었다. 따라서 향후 유망한 품종 개발을 위한 각 형질전환벼의 질소 및 인산의 균형여부를 구명하는 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 인산흡수율 증진유전자인 OsPT1, OsPT4, OsPT7과 OsPT8을 동진벼에 각각 도입하였다. 각 세대별 형질전환 여부를 확인하기 위하여 HPT primer(hygromycin, 471 bp)를 사용하였고(Fig. 1, Fig. 2), 이후 유전자 별 안정적인 도입 확인을 위하여 적정 primer set을 작성하였다(Table 1). 작성된 primer를 이용하여 T3세대 형질전환계통의 PCR 분석 후, 약배양을 실시하여 OsPT1-OX, OsPT4-OX, OsPT7-OX과 OsPT8-OX 고정계통을 양성하였다(Fig.
- 9 g)에 비해 작았다. 따라서 뿌리의 길이나 건물중만으로 각 형질전환계통의 특성을 비교하는데 어려움이 있어 지상부/지하부의 비율(T/R 율)을 비교해 보았다. T/R율은 10.
- 벼에서 인산흡수 관련 유전자를 이용하여 무기양분이 제한된 토양에서도 작물의 생장을 극대화시키는 무기영양 이용능력이 강화된 차세대 작물을 개발하고자 인산흡수력이 강화된 OsPT(Phosphate transporter)1, 4, 7, 8-OX 계통을 세대진전시켜 T5 세대에서 유전자의 안정적 도입을 확인하였다. 형질전환 계통들의 뿌리발달 상황을 조사해 본 결과, T/R율이 모든 형질전환 계통에서 동진벼보다 높은 경향을 보였다.
- 식물체 무기성분을 분석하기 위하여 벼의 주요 생육단계인 최고분얼기, 출수기 및 성숙기에 식물체 지상부를 채취하여 60℃에서 3일간 열풍 건조한 후 식물체 분쇄기로 마쇄하였다. 식물체 0.5 g을 H2SO4+HClO4 산 분해시킨 후 T-N은 질소자동분석기(FOSS 2300 Kjeltec U.S.A.), 인산은 Vanadate법, 양이온은 유도결합플라즈마(ICP, Perkin Elmer 3300 DV, U.S.A.)로 분석하였다.
- 식물체 무기성분을 분석하기 위하여 벼의 주요 생육단계인 최고분얼기, 출수기 및 성숙기에 식물체 지상부를 채취하여 60℃에서 3일간 열풍 건조한 후 식물체 분쇄기로 마쇄하였다. 식물체 0.
- 2), 이후 유전자 별 안정적인 도입 확인을 위하여 적정 primer set을 작성하였다(Table 1). 작성된 primer를 이용하여 T3세대 형질전환계통의 PCR 분석 후, 약배양을 실시하여 OsPT1-OX, OsPT4-OX, OsPT7-OX과 OsPT8-OX 고정계통을 양성하였다(Fig. 3).
- 포트시험 시 사용된 토양은 식량원 비료장기연용 시험구의 평택미사질양토인 인산결제 토양(NK)과 관행토양(NPK)을 이용하였다. 포트시험의 시비는(1/2 N)K, NK, NPK(N-P2O5-K2O; 9-4.5-5.7 kg/10a)의 3처리를 완전임의배치 5반복으로 수행하였다. 2006년 포장 시험은 식량원 GMO 포장에서 무비, 무인산(NK), 관행(NPK) 시비 3처리로 대조품종인 동진벼와 OsPT1, 4, 7, 8-OX(T4)을 이앙하여 단구제로 수행하였다.
- 형질전환계통과 모본인 동진벼를 5월12일에 파종하여 6월2일 주당 1본씩, 재식거리 15×30 cm 간격으로 식량원 GMO포장에 이앙하였다.
- 형질전환계통의 인산흡수력을 분석하기 위하여 2005~2007년에 경남 밀양 소재 국립식량과학원의 시험포장과 포트조건에서 각각 시비시험을 수행하였다. 2005년 포트시험을 위해 1/5,000 a pot에 동진벼 및 OsPT1, 4, 7, 8-OX(T3) 각 계통을 주당 1본씩 이앙하였다.
대상 데이터
- 인산흡수력이 강화된 OsPT(Oryza sativa Phosphate transporter)s 형질전환 벼를 개발하기 위하여 Agrobacterium법으로 형질전환한 식물체를 hygromycin 배지 상에서 선발하였다. 매 세대마다 hygromycin specific primers로 개체선발한 후 도입유전자의 유무에 따라 국립식량과학원 표준약배양법에 준하여 약배양을 수행하였다.
- 인산흡수율 증진유전자인 OsPT1, OsPT4, OsPT7과 OsPT8을 동진벼에 각각 도입하였다. 각 세대별 형질전환 여부를 확인하기 위하여 HPT primer(hygromycin, 471 bp)를 사용하였고(Fig.
- 2005년 포트시험을 위해 1/5,000 a pot에 동진벼 및 OsPT1, 4, 7, 8-OX(T3) 각 계통을 주당 1본씩 이앙하였다. 포트시험 시 사용된 토양은 식량원 비료장기연용 시험구의 평택미사질양토인 인산결제 토양(NK)과 관행토양(NPK)을 이용하였다. 포트시험의 시비는(1/2 N)K, NK, NPK(N-P2O5-K2O; 9-4.
이론/모형
- 매 세대마다 hygromycin specific primers로 개체선발한 후 도입유전자의 유무에 따라 국립식량과학원 표준약배양법에 준하여 약배양을 수행하였다. OsPTs 고정계통 선발을 위한 DNA 분석은 계통당 3~4엽기의 어린 잎 1 g을 채취하여 Chen and Ronalds(1999)의 방법으로 genomic DNA를 분리하여 gene specific primers를 이용하여 PCR을 통해 선발하였다.
- 형질전환계통의 토양 중 무기성분은 각 시험구 별로 시험 전후 토양을 채취하여 자연 건조한 후 분쇄하여 2 mm체로쳐 사용하였다. T-N은 Kjeldahl법, 유효인산은 Lancast법, 치환성양이온은 1N NH4OAc로 침출 후 유도결합플라즈마(ICP, Perkin Elmer 3300 DV, U.S.A.)로 분석하였다. 그 외 토양화학성분은 농업과학기술원 토양분석법(NIAST, 2000)에 의하여 분석하였다.
- )로 분석하였다. 그 외 토양화학성분은 농업과학기술원 토양분석법(NIAST, 2000)에 의하여 분석하였다.
- 인산흡수력이 강화된 OsPT(Oryza sativa Phosphate transporter)s 형질전환 벼를 개발하기 위하여 Agrobacterium법으로 형질전환한 식물체를 hygromycin 배지 상에서 선발하였다. 매 세대마다 hygromycin specific primers로 개체선발한 후 도입유전자의 유무에 따라 국립식량과학원 표준약배양법에 준하여 약배양을 수행하였다. OsPTs 고정계통 선발을 위한 DNA 분석은 계통당 3~4엽기의 어린 잎 1 g을 채취하여 Chen and Ronalds(1999)의 방법으로 genomic DNA를 분리하여 gene specific primers를 이용하여 PCR을 통해 선발하였다.
- 기타 재배법은 관행에 준하여 시험을 수행하였다. 주요 농업적 특성조사는 분얼기, 최고분얼기 및 성숙기에 농촌진흥청 농사시험연구조사기준에 의해 수행되었다.
성능/효과
- 6, Table 5와 같다. K2O, CaO, MgO의 함량은 시험구별 큰 차이가 없었고, P2O5 함량은 형질전환계통이 동진벼에 비하여 많았다. 포장시험 결과, 관행토양+NK시비구에서 식물체 인산함량(P2O5, %)은 OsPT1, 4, 7, 8-OX 계통이 동진벼에 비해 각각 3.
- 13과 같다. OsPT1-OX 계통의 줄기, 잎, 현미, 영에서 각각 0.33, 0.18, 0.12, 0.004 g으로 나타났다. 줄기와 잎의 함량은 동진벼의 2.
- 장간의 개체는 인산흡수량이 동진벼와 비슷하고, 출수 시 이삭목의 빠짐이 정상이었다. OsPT4-OX 후대에서 분리된 단간, 중간과 장간종은 각기 OsPT4/OsPT4, OsPT4/-과 -/-(동진벼 wild type)으로, 식물체 내 OsPT4의 발현량에 따라 과도한 인산집적으로 각 계통이 간장과 이삭목 추출도가 분리되는 것으로 생각되었다. 따라서 향후 유망한 품종 개발을 위한 각 형질전환벼의 질소 및 인산의 균형여부를 구명하는 연구를 수행하였다.
- OsPTs-OX의 인산함량(%)을 분석한 결과, OsPT4- OX >1-OX >7-OX >8-OX 순으로 나타난 반면, OsPT1-OX이 인산흡수율이 높으면서도 생육의 변화가 적어 개체당 총인산흡수량(g/개체)은 OsPT1-OX >4-OX >7-OX >8-OX 순으로 OsPT1-OX이 인산흡수증진 신품종으로 가장 유망하였다.
- 시험 전 178 mg/kg이었던 토양 중 Av. P2O5(mg/kg)함량은 시험 후 동진벼 및 OsPT1, 4, 7, 8-OX 시험구에서 각각 163, 149, 152, 156, 169 mg/kg으로 감소하였다. 이는 식물체 총 인산흡수량(g/개체) 결과와 일관성을 보였다(Fig.
- 14%로 차이가 있었다. P2O5/T-N 함량비율(P/N율)을 비교하였을 때, OsPT1-OX, 4-OX 계통이 각각 0.77, 0.81로 동진벼(0.41)에 비해 약 2배 높았다.
- 10). 따라서 최고생육을 나타내는 적정 P/N율 조건은 각 형질전환 유전자 별로 다르며 이는 질소 시비로 조절될 수 있음을 알 수 있었다. 이상에서 OsPT1-OX 과 OsPT4-OX를 농업적으로 활용할 시 관행보다 질소비료의 양을 늘여주는 것이 효율을 높일 것으로 생각된다.
- OsPTs-OX의 간장감소의 원인구명과 현상개선을 위하여 몇 가지 시험이 수행되었다. 먼저 간장 감소가 가장 컸던, OsPT4-OX를 세대 진전시키자 간장이 장간, 중간과 단간 3종으로 분리되었다(Fig. 8). 유전자 도입여부를 확인하고자 시행한 Hygromycin 처리시 단간과 중간의 개체는 저항성이고 장간은 감수성이었다.
- 분석결과 형질전환계통 내 인산과 질소간 불균형이 간장과 이삭목 추출도 등에 영향을 미친 것으로 생각되었다. 따라서 질소시비의 조절로 형질전환계통의 정상 간장을 확보할 수 있을 것으로 보고 질소시비시험을 수행하였다.
- 생육시기별 식물체 인산함량을 분석한 결과, 전 생육기간에 걸쳐 형질전환계통의 인산함량이 동진벼보다 많았으며 특히, OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통의 인산함량이 현저하게 높았다. 분얼기에는 OsPT4-OX 계통의 인산함량이 1.
- 14%로 비슷하였다. 생육이 진전됨에 따라 식물체 인산함량은 계속 감소하였으나 OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통은 성숙기까지 다른 계통에 비하여 인산 함량을 높게 유지하였다(Fig. 6). 이로써 동진벼에 도입된 각각의 유전자 중 OsPT1과 OsPT4의 인산흡수력이 가장 높으며 이들 형질전환계통이 새로운 품종으로 유망한 것으로 보였다.
- 8). 유전자 도입여부를 확인하고자 시행한 Hygromycin 처리시 단간과 중간의 개체는 저항성이고 장간은 감수성이었다. 장간의 개체는 인산흡수량이 동진벼와 비슷하고, 출수 시 이삭목의 빠짐이 정상이었다.
- 5). 이로부터 OsPTs가 벼의 뿌리생육에 변이를 일으켜 인산결핍 조건에 적응할 수 있도록 하였으며 이로 인해 간장, 수장, 출수기 및 쌀수량이 개선됨을 알 수 있었다. 더불어 본 연구에서 OsPT4-OX 계통에서 과다한 인산흡수 시 오히려 출수기가 지연되는 현상에서 식물체 수량확보를 위한 출수기 조절에 있어 인산과 질소간의 상호작용에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
- 4)보다 큰 값을 보였다(Table 2). 이로써 OsPTs 유전자의 발현이 벼의 뿌리 생장에 변화를 가져왔으며 그 변이는 유전자 별로 차이가 있음을 알 수 있었다.
- 6). 이로써 동진벼에 도입된 각각의 유전자 중 OsPT1과 OsPT4의 인산흡수력이 가장 높으며 이들 형질전환계통이 새로운 품종으로 유망한 것으로 보였다. 따라서 OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통의 농업적 특성을 좀더 분석해 볼 필요가 있었다.
- 따라서 최고생육을 나타내는 적정 P/N율 조건은 각 형질전환 유전자 별로 다르며 이는 질소 시비로 조절될 수 있음을 알 수 있었다. 이상에서 OsPT1-OX 과 OsPT4-OX를 농업적으로 활용할 시 관행보다 질소비료의 양을 늘여주는 것이 효율을 높일 것으로 생각된다.
- 인산흡수력이 우수하였던 OsPT1-OX과 4-OX 계통은 시설재배지 등 인산 과다집적 토양에서 인산 제거력이 커 하천 부영양화 방지에도 크게 기여할 것으로 생각되며 특히 OsPT1-OX 계통은 인산제거용 품종으로 가장 적합할 것으로 판단되었다.
- K2O, CaO, MgO의 함량은 시험구별 큰 차이가 없었고, P2O5 함량은 형질전환계통이 동진벼에 비하여 많았다. 포장시험 결과, 관행토양+NK시비구에서 식물체 인산함량(P2O5, %)은 OsPT1, 4, 7, 8-OX 계통이 동진벼에 비해 각각 3.0, 3.0, 1.1, 1.2배를 보였으며, OsPT1-OX, OsPT4-OX 계통의 경우, 관행토양+NPK시비구에서의 동진 벼보다도 인산함량이 더 높았다.
- 포장시험에서 관행시비(NPK)대비 NK구에서 동진벼는 간장이 7% 감소하였으나 형질전환계통에서는 0~3% 감소에 그쳤으며 이 중 OsPT7-OX의 생육이 가장 양호하였다(Table 3). 수수는 1~2개 감소하였으나 계통간에 차이가 없었으며 현미천립중은 형질전환계통에서 다소 감소하였고 시비처리간 차이는 없었다.
- 세대에서 유전자의 안정적 도입을 확인하였다. 형질전환 계통들의 뿌리발달 상황을 조사해 본 결과, T/R율이 모든 형질전환 계통에서 동진벼보다 높은 경향을 보였다. OsPT1-OX 및 OsPT4-OX 계통은 모본인 동진벼에 비해 전반적으로 초장, 간장 및 수장은 짧았으나 OsPT7-OX 및 OsPT8-OX 계통은 주요 농업적 특성이 비슷하였다.
후속연구
- 이로부터 OsPTs가 벼의 뿌리생육에 변이를 일으켜 인산결핍 조건에 적응할 수 있도록 하였으며 이로 인해 간장, 수장, 출수기 및 쌀수량이 개선됨을 알 수 있었다. 더불어 본 연구에서 OsPT4-OX 계통에서 과다한 인산흡수 시 오히려 출수기가 지연되는 현상에서 식물체 수량확보를 위한 출수기 조절에 있어 인산과 질소간의 상호작용에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
- 이로써 동진벼에 도입된 각각의 유전자 중 OsPT1과 OsPT4의 인산흡수력이 가장 높으며 이들 형질전환계통이 새로운 품종으로 유망한 것으로 보였다. 따라서 OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통의 농업적 특성을 좀더 분석해 볼 필요가 있었다. 또한 Howitt와 Udvardi(2000)의 암모늄이온(NH4+) 운반체계는 고친화 운반체계(HAT; high-affinity transport system)와 저친화 운반체계(LAT; low-affinity transport system)로 구분된다는 실험결과로 미루어 인산 운반체계의 연구가 더 필요할 것으로 생각되었다.
- 따라서 벼에서 인산이용 시 발현되는 유전자들의 분리 및 기능분석이 절실하며, 이러한 인산흡수 및 고정화 인산 유효화 관련 유전자를 이용하여 토양의 인산 이용성이 향상된 친환경성 벼 품종 개발이 요구된다. 아울러 무기양분이 제한된 토양에서도 무기영양 이용능력이 강화된 차세대 작물 개발 연구도 필요한 실정이다.
- 따라서 OsPT1-OX과 OsPT4-OX 계통의 농업적 특성을 좀더 분석해 볼 필요가 있었다. 또한 Howitt와 Udvardi(2000)의 암모늄이온(NH4+) 운반체계는 고친화 운반체계(HAT; high-affinity transport system)와 저친화 운반체계(LAT; low-affinity transport system)로 구분된다는 실험결과로 미루어 인산 운반체계의 연구가 더 필요할 것으로 생각되었다.
- 2배였으나 현미와 영은 차이가 없었다. 이로써 OsPT1-OX은 인산흡수율이 높으면서도 섭식 부위인 백미의 인산함량에 변이가 없어 인산제거용 용도 이외에도 무기질이 부족한 특수 환경에서 수량을 확보하는데 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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