다양한 탄수화물 분해에 따른 xylitol-sensitive Streptococcus mutans와 xylitol-resistant Streptococcus mutans의 특성 비교 Comparison of characteristics of xylitol-sensitive and xylitol-resistant Streptococcus mutans by use of various carbohydrates원문보기
본 연구는 다양한 탄수화물 아래에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 치아우식과 관련된 특성을 비교해보고자 하였다. 이를 위하여 1% 자일리톨이 첨가된 TYE 배지에서 S. mutans를 30일간 배양하여 자일리톨 내성균주를 형성하였으며, 이후 0.5% 포도당이 포함된 배지에 자당, 과당, 엿당을 첨가하여 성장, 산생성, 세포외부 다당류 합성정도를 평가하였다. 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 최종 성장이 유의하게 낮았으며(p<0.05), 산생성에는 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 자일리톨 내성균주의 세포외부 다당류 합성은 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 대체로 자일리톨 감성균주에 비해 낮았으며, 특히 엿당 상에서 뚜렷하게 낮았다. 이상의 결과들을 종합해 보았을 때, 자일리톨 감성균주와 내성균주의 독력인자 발현 정도는 탄수화물의 종류에 따라 차이를 보이기는 하나, 자일리톨 내성균주의 독력이 자일리톨 감성균주에 비해 대체로 낮으므로, 자일리톨의 장기적인 섭취에 의해 형성된 구강 내 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 치아우식예방에 더 유리할 것으로 생각된다.
본 연구는 다양한 탄수화물 아래에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 치아우식과 관련된 특성을 비교해보고자 하였다. 이를 위하여 1% 자일리톨이 첨가된 TYE 배지에서 S. mutans를 30일간 배양하여 자일리톨 내성균주를 형성하였으며, 이후 0.5% 포도당이 포함된 배지에 자당, 과당, 엿당을 첨가하여 성장, 산생성, 세포외부 다당류 합성정도를 평가하였다. 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 최종 성장이 유의하게 낮았으며(p<0.05), 산생성에는 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 자일리톨 내성균주의 세포외부 다당류 합성은 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 대체로 자일리톨 감성균주에 비해 낮았으며, 특히 엿당 상에서 뚜렷하게 낮았다. 이상의 결과들을 종합해 보았을 때, 자일리톨 감성균주와 내성균주의 독력인자 발현 정도는 탄수화물의 종류에 따라 차이를 보이기는 하나, 자일리톨 내성균주의 독력이 자일리톨 감성균주에 비해 대체로 낮으므로, 자일리톨의 장기적인 섭취에 의해 형성된 구강 내 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 치아우식예방에 더 유리할 것으로 생각된다.
The aim of this study was to investigate the capacity of the xylitol-sensitive(Xs) and xylitol-resistant(Xr) S. mutans to induce dental caries in the presence of various carbohydrate. S. mutans KCTC3065 was cultured with 0.4% glucose and 1% xylitol in TYE medium for 30 days at $37^{\circ}C$
The aim of this study was to investigate the capacity of the xylitol-sensitive(Xs) and xylitol-resistant(Xr) S. mutans to induce dental caries in the presence of various carbohydrate. S. mutans KCTC3065 was cultured with 0.4% glucose and 1% xylitol in TYE medium for 30 days at $37^{\circ}C$, 10% $CO_2$ to form Xr S. mutans. Both Xs and Xr strains were cultured in four different carbohydrate environments; 0.5% glucose containing basal culture TYE medium(G-TYE), G-TYE plus 0.5% sucorse, G-TYE plus 0.5% fructose, G-TYE plus 0.5% maltose. Then cell growth, acid production, and extracellular polysaccharides synthesis were analyzed. The final growth level and extracellular polysaccharides contents in the Xr strain were significantly lower than in the Xs strain in all carbohydrates except fructose. While, acid production was no significantly difference between Xs and Xr strain. These results indicate that the virulence of Xr strains is significantly lower than that of Xs strains, which supports Xr strains may be less cariogenic than Xs strains.
The aim of this study was to investigate the capacity of the xylitol-sensitive(Xs) and xylitol-resistant(Xr) S. mutans to induce dental caries in the presence of various carbohydrate. S. mutans KCTC3065 was cultured with 0.4% glucose and 1% xylitol in TYE medium for 30 days at $37^{\circ}C$, 10% $CO_2$ to form Xr S. mutans. Both Xs and Xr strains were cultured in four different carbohydrate environments; 0.5% glucose containing basal culture TYE medium(G-TYE), G-TYE plus 0.5% sucorse, G-TYE plus 0.5% fructose, G-TYE plus 0.5% maltose. Then cell growth, acid production, and extracellular polysaccharides synthesis were analyzed. The final growth level and extracellular polysaccharides contents in the Xr strain were significantly lower than in the Xs strain in all carbohydrates except fructose. While, acid production was no significantly difference between Xs and Xr strain. These results indicate that the virulence of Xr strains is significantly lower than that of Xs strains, which supports Xr strains may be less cariogenic than Xs strains.
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문제 정의
본 연구는 포도당, 자당, 과당, 엿당과 같은 주요 탄수화물 아래에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 특성을 비교함으로써 실제 구강 내 환경을 최대한 동일하게 재현하였다는 데 의의가 있다. 그러나 연구에 표준균주를 사용하였기 때문에 실제 구강 내에 존재하는 S.
이에 본 연구에서는 실제 구강 환경을 재현하기 위하여 포도당이 포함되어 있는 배지를 기본배지로 사용하고 자당, 과당, 엿당을 각각 첨가한 후, 이를 분해하는 자일리톨 감성균주와 내성균주의 특성 및 치아우식증과 관련된 독력들을 비교하고자 하였다.
제안 방법
0.2%의 포도당과 1%의 자일리톨이 첨가된 TYE 액체 배지 또는 0.2%의 포도당만 첨가된 TYE 액체배지 10 ml에 S. mutans를 접종하여 12시간 동안 배양하였으며, 매시간마다 S. mutans의 성장 정도를 확인하였다. 자일리톨을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지의 성장곡선이 동일한 경우 이를 자일리톨 내성균주로 정의하였으며, 자일리톨에 의해 성장이 뚜렷하게 억제되는 경우를 자일리톨 감성균주로 간주하였다.
0.5%의 포도당이 포함된 TYE 액체배지를 기본배지로 하여, 자당, 과당, 엿당 세 가지의 탄수화물을 최종 농도가 0.5%, 총량이 10 ml이 되도록 첨가하였다.
mutans를 접종하여 37℃, 10% CO2에서 배양하였다. 24시간마다 0.1 ml의 세균배양액을 동일한 조성의 새로운 배지 10 ml에 재배양 하였으며, 이를 30일간 반복하고, 매 10일마다 MSB 배지에서 2일간 배양하여 타균에 대한 오염도를 확인하였다. 대조군(자일리톨 감성균주)은 자일리톨을 첨가하지 않고 동일한 조건으로 배양하였다.
S. mutans를 각각의 배지에 OD600이 0.05가 되도록 접종하여 37℃, 10% CO2에서 12시간 동안 배양하였으며, 매 시간마다 배양액의 흡광도를 600 nm의 파장에서 ELISA(ASYS, Austria)를 사용하여 측정하였다. 또한 산생성 정도를 알아보기 위하여 배양액을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액의 산생성 정도를 pH meter(Radiometer Analytical, France)를 사용하여 측정하였다.
각각의 탄수화물이 함유된 배지에서 S. mutans를 12시간 동안 배양한 후 회수하여, 통상적인 절차들에 의해 고정, 탈수, 포매 과정을 거쳤다. 포매된 시료는 70 nm 두께의 초박절편기(Ultracut uct, Leica, Germany; Korea Basic Science Institute, Daejeon, Korea)를 사용하여 절편(ultrathin section)을 제작하고, 이중염색한 후, 생물전용 투과전자현미경(Bio-TEM)(Tecnai G2 Spirit, FEI Co.
1 ml의 세균배양액을 동일한 조성의 새로운 배지 10 ml에 재배양 하였으며, 이를 30일간 반복하고, 매 10일마다 MSB 배지에서 2일간 배양하여 타균에 대한 오염도를 확인하였다. 대조군(자일리톨 감성균주)은 자일리톨을 첨가하지 않고 동일한 조건으로 배양하였다.
05가 되도록 접종하여 37℃, 10% CO2에서 12시간 동안 배양하였으며, 매 시간마다 배양액의 흡광도를 600 nm의 파장에서 ELISA(ASYS, Austria)를 사용하여 측정하였다. 또한 산생성 정도를 알아보기 위하여 배양액을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액의 산생성 정도를 pH meter(Radiometer Analytical, France)를 사용하여 측정하였다.
mutans를 12시간 동안 배양한 후 회수하여, 통상적인 절차들에 의해 고정, 탈수, 포매 과정을 거쳤다. 포매된 시료는 70 nm 두께의 초박절편기(Ultracut uct, Leica, Germany; Korea Basic Science Institute, Daejeon, Korea)를 사용하여 절편(ultrathin section)을 제작하고, 이중염색한 후, 생물전용 투과전자현미경(Bio-TEM)(Tecnai G2 Spirit, FEI Co., OR, USA; Korea Basic Science Institute, Daejeon, Korea)을 사용하여 S. mutans의 세포외부 다당류 합성 정도를 관찰하였다.
대상 데이터
0.4% 포도당(Sigma Chemical, MO, USA)이 포함된 TYE 액체배지(Tryptone yeast extract: Difco Laboratories, MD, USA; 1.7% tryptone: Difco Laboratories, MD, USA;0.3% yeast extract: Difco Laboratories, MD, USA; 0.5% sodium chloride: Sigma Chemical, MO, USA; 0.25% potassium phosphate: Sigma Chemical, MO, USA) 10 ml에 자일리톨(Sigma Chemical MO, USA)을 최종농도가 1%가 되도록 첨가한 후, S. mutans를 접종하여 37℃, 10% CO2에서 배양하였다. 24시간마다 0.
데이터처리
사후검정의 통계적 유의성 판단에서는 Bonferroni 방법으로 유의수준을 보정하여 해석하였다. 또한 자일리톨 감성균주와 내성균주 사이의 성장 및 산생성 차이는 Mann-Whitney 검정을 이용하여 비교하였다. 모든 통계분석에서 유의성 판정을 위한 유의수준은 5%로 고려하였다.
05), Wilcoxon의 순위합 검정을 이용하여 사후 검정을 수행하였다. 사후검정의 통계적 유의성 판단에서는 Bonferroni 방법으로 유의수준을 보정하여 해석하였다. 또한 자일리톨 감성균주와 내성균주 사이의 성장 및 산생성 차이는 Mann-Whitney 검정을 이용하여 비교하였다.
수합된 모든 자료는 통계분석용 소프트웨어인 SPSS 17.0 프로그램(SPSS Inc, IL, USA)을 이용하여 분석하였다. 탄수화물 종류에 따른 자일리톨 감성균주와 내성균주 각각의 성장 및 산생성 차이는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 분석하였으며, 통계적으로 유의한 차이가 인정되는 경우(p<0.
탄수화물 종류에 따른 자일리톨 감성균주와 내성균주 각각의 성장 및 산생성 차이는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 분석하였으며, 통계적으로 유의한 차이가 인정되는 경우(p<0.05), Wilcoxon의 순위합 검정을 이용하여 사후 검정을 수행하였다.
성능/효과
각 균주에서 탄수화물 종류에 따른 성장을 비교하였을 때, 자일리톨 내성균주는 배지에 첨가된 모든 탄수화물들 간에 유의한 차이를 나타낸 반면(p0.008), 두 균주 모두 엿당이 존재하는 경우 가장 높은 성장을 보였다.
자일리톨 감성균주의 경우 과당과 엿당 존재 시 가장 많은 다당류가 관찰되었으며, 자일리톨 내성균주의 경우 역시 과당 존재 시 가장 많은 다당류가 관찰되었으나, 엿당 상에서는 과당에 비해 적은 양의 다당류가 형성되었다. 각 탄수화물 상에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 다당류 합성정도를 비교하였을 때에는 과당의 경우 별다른 차이를 보이지 않았으나, 엿당의 경우에는 자일리톨 내성균주의 다당류 합성이 감성 균주에 비해 현저히 적었다. 포도당이 포함된 기본배지와 자당 역시 자일리톨 내성균주에 비해 적은 양의 다당류를 합성하는 것으로 나타났다.
각각의 탄수화물 상에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 성장을 비교하였을 때는, 포도당이 포함된 기본배지와 자당, 엿당 상에서는 자일리톨 내성균주의 성장이 감성균주에 비해 유의하게 낮았으나(p<0.05) 과당 상에서는 자일리톨 내성균주의 성장이 감성균주에 비해 유의하게 높았다(p<0.05).
또한 본 연구에서는 과당을 제외한 모든 탄수화물 아래에서 자일리톨 내성균주의 최종성장이 자일리톨 감성균주에 비해 낮게 나타났으며, 세포외부 다당류 합성 정도를 투과전자현미경으로 관찰한 결과에서도 자일리톨 내성균주의 다당류 합성은 과당을 제외한 탄수화물 상에서 자일리톨 감성균주에 비해 대체로 감소되어 있었다. 이와 같은 결과는 전자현미경을 통해 자일리톨 내성균주와 감성균주의 다당질 축적양상이 서로 다름을 보고한 Lafleche와 Trahan[25]의 연구와 자일리톨 내성균주가 감성균주보다 부착능력이 감소하여 치면세균막으로부터 타액으로의 유리를 용이하게 한다고 하였던 Trahan 등[14]의 보고와 일치하는 것으로 자일리톨 내성균주가 감성균주에 비해 부착력과 응집력이 낮기 때문에 치아우식유발력이 감소한다고 보고한 Sӧderling과 Trahan[26]의 주장을 지지한다고 하겠다.
이에 본 연구에서는 자일리톨 감성균주와 내성균주의 특성 차이에 있어 탄수화물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 다양한 탄수화물 상에서 두 균주의 특성을 비교한 결과, 두 균주 모두 기본 배지에 비해 두 분자의 포도당이 결합된 구조인 엿당이 포함된 배지에서 더 높은 성장을 보이고, 자당과 과당이 포함된 배지에서 더 낮은 성장을 보여 정 등[23]과 김 등[24]의 결과와 일치하였다. 이러한 결과는 S.
Lavoie와 Trahan[17] 역시 실험균주의 경우 자일리톨 내성균주의 유리 표면에 대한 자당 의존적인 부착 능력이 감성균주에 비해 2배 더 높게 나타났다고 하였다. 이와 같이 상반되는 결과들로 인하여 자일리톨 내성균주의 우식유발능력이 자일리톨 감성균주에 비해 약화되었다고 단정지을 수는 없으며, 아직 확실한 결론을 얻지 못하고 있다. 그러므로 자일리톨 내성균주의 형성 기전 및 원인을 밝히고, 자일리톨 감성균주와의 특성 차이를 밝히는 것은 매우 중요하다.
mutans의 산생성을 관찰한 결과이다. 자일리톨 감성균주와 내성균주 모두 탄수화물들 간에 전체적으로 산생성에 유의한 차이를 보였으나 두 균주 사이에서는 유의한 차이를 관찰할 수 없었다.
그림 3은 탄수화물 종류에 따른 자일리톨 감성균주와 내성균주의 세포외부 다당류 합성 정도를 투과전자현미경으로 관찰한 결과이다. 자일리톨 감성균주의 경우 과당과 엿당 존재 시 가장 많은 다당류가 관찰되었으며, 자일리톨 내성균주의 경우 역시 과당 존재 시 가장 많은 다당류가 관찰되었으나, 엿당 상에서는 과당에 비해 적은 양의 다당류가 형성되었다. 각 탄수화물 상에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 다당류 합성정도를 비교하였을 때에는 과당의 경우 별다른 차이를 보이지 않았으나, 엿당의 경우에는 자일리톨 내성균주의 다당류 합성이 감성 균주에 비해 현저히 적었다.
각 탄수화물 상에서 자일리톨 감성균주와 내성균주의 다당류 합성정도를 비교하였을 때에는 과당의 경우 별다른 차이를 보이지 않았으나, 엿당의 경우에는 자일리톨 내성균주의 다당류 합성이 감성 균주에 비해 현저히 적었다. 포도당이 포함된 기본배지와 자당 역시 자일리톨 내성균주에 비해 적은 양의 다당류를 합성하는 것으로 나타났다.
후속연구
mtuans의 또 다른 독력인자 중의 하나인 산생성의 경우, 모든 탄수화물 상에서 두 균주 사이에 유의한 차이가 없어, 자일리톨 내성균주가 감성균주에 비해 더 많은 유산을 생산한다고 보고한 Assev 등[16]의 결과와는 다소 차이를 보였다. Soyer와 Frank[27]는 유리된 젖산을 측정함으로써 pH 감소가 S. mtuans의 성장과 관련이 있음을 보고하였으나, 본 실험에서는 산생성 결과는 성장 결과와 같이 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며, 이는 향후 S. mutans의 산생성과 관련된 유전자 연구를 통하여 좀 더 명확한 결론을 얻을 수 있을 것이라 생각한다.
또한 S. mutans와 탄수화물은 서로 밀접한 관련을 가지고 있으므로 자일리톨 내성균주의 형성 및 독력변화에도 탄수화물이 상당한 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다. 김 등[18]은 자당 존재 하에서 자일리톨이 S.
향후 연구에서는 실제 구강 내에서 분리한 균주를 대상으로 다양한 탄수화물이 복합적으로 섞여 있을 경우에 자일리톨 감성균주와 내성균주의 특성을 평가하여야겠으며, 이를 평가하는데 있어 다양한 실험방법과 새로운 분석방법들을 통하여 보다 심층적인 연구가 진행되어져야 하겠다. 또한 단순히 자일리톨 감성균주와 내성균주의 독력을 비교하는 단계에서 나아가 자일리톨을 처리하였을 경우에 두 균주의 독력을 비교함으로써 장기적인 자일리톨 섭취에도 치아 우식 예방 효과가 지속되는지를 평가하는 연구가 진행되어져야 하겠다.
mutans의 특성과는 다소 차이가 있을 것이다. 향후 연구에서는 실제 구강 내에서 분리한 균주를 대상으로 다양한 탄수화물이 복합적으로 섞여 있을 경우에 자일리톨 감성균주와 내성균주의 특성을 평가하여야겠으며, 이를 평가하는데 있어 다양한 실험방법과 새로운 분석방법들을 통하여 보다 심층적인 연구가 진행되어져야 하겠다. 또한 단순히 자일리톨 감성균주와 내성균주의 독력을 비교하는 단계에서 나아가 자일리톨을 처리하였을 경우에 두 균주의 독력을 비교함으로써 장기적인 자일리톨 섭취에도 치아 우식 예방 효과가 지속되는지를 평가하는 연구가 진행되어져야 하겠다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
S. mutans의 특징은?
S. mutans는 다른 세균들보다 상대적으로 산내성 경향이 높고[2], 다양한 종류의 탄수화물을 발효시킬 수 있어 다량의 산을 생성할 수 있다[3]. 또한 자당으로부터 glucosyltransferase(GTF)를 이용하여 세포외부에 글루칸을 형성함으로써 치면에 집락화를 증진시키고, 탄수화물로부터 생성된 산과 지속적으로 접촉하게 되면서 법랑질 탈회를 가속화시킨다[4,5].
자일리톨 감성균주와 내성균주의 치아우식은 각각 어느정도로 나타났는가?
5% 포도당이 포함된 배지에 자당, 과당, 엿당을 첨가하여 성장, 산생성, 세포외부 다당류 합성정도를 평가하였다. 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 최종 성장이 유의하게 낮았으며(p<0.05), 산생성에는 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 자일리톨 내성균주의 세포외부 다당류 합성은 과당을 제외한 모든 탄수화물 상에서 대체로 자일리톨 감성균주에 비해 낮았으며, 특히 엿당 상에서 뚜렷하게 낮았다. 이상의 결과들을 종합해 보았을 때, 자일리톨 감성균주와 내성균주의 독력인자 발현 정도는 탄수화물의 종류에 따라 차이를 보이기는 하나, 자일리톨 내성균주의 독력이 자일리톨 감성균주에 비해 대체로 낮으므로, 자일리톨의 장기적인 섭취에 의해 형성된 구강 내 자일리톨 내성균주는 자일리톨 감성균주에 비해 치아우식예방에 더 유리할 것으로 생각된다.
자일리톨 내성균주란 무엇인가?
mutans가 자일리톨에 지속적으로 노출되면 자일리톨에 대한 민감성을 상실하여 더 이상 증식억제가 일어나지 않는 균주가 형성된다고 주장하였으며, Trahan과 Mouton[12]은 자일리톨을 장기간 섭취한 사람의 구강 내에서도 자일리톨에 내성을 갖는 균주가 발견되었다고 보고하였다. 이처럼 자일리톨에 지속적으로 노출될 경우 더 이상 자일리톨에 의해 성장이 억제되지 않는 변이종이 형성되는데, 이러한 균주를 자일리톨에 내성을 가졌다고 하여 자일리톨 내성균주(xylitol-resistant S. mutans: Xr)라고 하며, 자일리톨에 의해 성장이 억제되는 균주를 자일리톨 감성균주(xylitol-sensitive S.
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