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문제 정의
- 본 연구에서는 십전대보탕을 재료로 8종의 다른 유산균을 이용하여 발효 전후의 십전대보탕의 성분 변화를 관찰하고 향후 발효 한약으로서의 십전대보탕의 가치를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- breve KFRI 744은 Reinforced Clostridial Medium(Difco)에서 계대 배양한 뒤 초기균수를 1×106 CFU/mL로 조절하여 inoculum으로 사용하였다. 1N NaOH를 이용하여 여과한 십전대보탕의 pH를 7.0으로 조정한 후 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균하고, 상온까지 냉각시킨 후, 유산균을 1%(v/v)로 접종하고 37℃의 항온배양기에서 48시간 동안 정치 배양을 한 후 standard testing sieve로 여과하여 동결 건조하여 분석에 사용하였다.
- plantarum KFRI 144 발효물로부터 3개의 증가한 peak의 분리 정제를 수행한 후 분광학적 분석 방법에 의해 구조를 규명하였다. 2개의 감소한 성분은 표준 물질의 tR(retention time) 및 DAD spectrum과 비교 분석하여 성분 규명을 수행하였다.
- Cinnamyl alcohol은 400, 200, 50, 12.5, 3.13 µg/mL, liquiritin은 55, 13.75, 3.43, 0.85, 0.21 µg/mL, liquiritigenin은 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39 µg/mL, nodakenin은 250, 62.5, 15.63, 3.91, 0.98 µg/mL, nodakenetin은 100, 25, 6.25, 1.56, 0.39 µg/mL의 농도로 단계적으로 희석한 시료를 분석하여 검량선을 작성하였으며, 십전대보탕 및 발효 십전대보탕의 검액은 40 mg/mL의 농도로 조제한 후 syringe filter(PVDF, 0.45 µm, non-sterile, Advantec MFS Inc., Japan)로 여과하여 분석하였다(Table 1).
- 1a)로 구성되어있다. NMR spectrum은 Varian사의 INOVA 600, INOVA 400NB NMR(Varian Co., USA), Bruker사의 AVANCE 500 MHz, 300 MHz NMR(Bruker Co., Germany)로 부터, low-resolution ESI, EI MS spectrum은 ESI-IT-TOFMS(Shimadzu Co. Japan)와 JMS-600W EI-MS(JEOL Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. Prep HPLC는 Gilson pep HPLC(Wisconsin, USA)를 사용하여 성분을 분리하였으며, 333, 334 pump, UV/VIS151 detector로 구성되어 있다.
- plantarum KFRI 144 동결 건조물에서 용매 분획 및 각종 chromatographic 기술을 이용하여 발효 후 증가한 3종 성분을 분리 정제 후 NMR, MS 분석을 이용하여 cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3), nodakenetin (5)으로 화학 구조를 규명하였다. 또한 이들 증감 성분 5종 에 대하여 십전대보탕 및 8종의 유산균 발효물에 대하여 정량 분석을 수행하여 유산균주별 성분 변화를 관찰하였으며, 다음과 같은 결론을 도출 할 수 있었다.
- 증가한 3종의 성분은 각종 크로마토그래픽 기술을 이용하여 분리 정제 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석기법을 이용하여 구조를 규명하였으며, cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3) 및 nodakenetin (5)으로 규명되었다. 발효 후 감소한 성분은 표준품과 HPLC 비교분석(retention time, DAD spectrum)을 통하여 liquiritin (2) 및 nodakenin (4)으로 구조를 규명하였다. 8종의 유산 균주로 발효한 십전대보탕의 성분 변화를 분석한 결과 L.
- 십전대보탕 원탕과 8종의 십전 대보탕 유산균 발효물을 HPLC/DAD를 이용하여 비교 분석한 결과 8종의 발효물에서 3개의 증가한 peak와 2개의 감소한 peak를 관찰되었으며, 8종 발효물 중 가장 뚜렷한 변화를 보인 L. plantarum KFRI 144 발효물로부터 3개의 증가한 peak의 분리 정제를 수행한 후 분광학적 분석 방법에 의해 구조를 규명하였다. 2개의 감소한 성분은 표준 물질의 tR(retention time) 및 DAD spectrum과 비교 분석하여 성분 규명을 수행하였다.
- 십전대보탕의 발효 전 후 성분 변화를 분석하기 위해 8종의 유산균을 이용하여 발효한 십전대보탕과 발효하지 않은 십전대보탕을 비교 분석하여 발효 후 증가한 3종의 성분과 감소한 2종의 성분을 규명하여 각 유산 균주에 대하여 5종 성분의 정량 분석을 실시하였다. 증가한 3종의 성분은 각종 크로마토그래픽 기술을 이용하여 분리 정제 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석기법을 이용하여 구조를 규명하였으며, cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3) 및 nodakenetin (5)으로 규명되었다.
- plantarum KFRI 144로 발효하여 얻어진 발효 십전대보탕의 건조분말 20 g을 물에 suspension하여 ethyl acetate, n-BuOH 순으로 용매 분획 후 이들 용매 분획을 HPLC 분석을 한 결과 발효 후 증가성분이 ethyl acetate 분획에 존재하는 것을 확인하여 ethyl acetate 분획에 대하여 발효 후 증가 성분의 분리를 실시하였다. 우선 ethyl acetate 분획(1.0 g)에 대하여 C18 flash column chromatography(100% H2O, 20%, 40%, 60%, 80, 100% MeOH)를 실시하여 7개의 분획으로(F1-F7) 나누었다. 이 중 F5 분획(300 mg)을 60% MeOH를 유출용매로 하여 C18 open column chromatography를 실시하여 4개의 분획으로 나누었다(F51-F54).
- 0 g)에 대하여 C18 flash column chromatography(100% H2O, 20%, 40%, 60%, 80, 100% MeOH)를 실시하여 7개의 분획으로(F1-F7) 나누었다. 이 중 F5 분획(300 mg)을 60% MeOH를 유출용매로 하여 C18 open column chromatography를 실시하여 4개의 분획으로 나누었다(F51-F54). 이 중 F52(80 mg) 분획을 prep HPLC(chloroform/methanol, 20:1)를 이용하여 compound 3(2.
- 정량 분석은 지표 성분의 면적을 검량선에 대입하여 십전대보탕 및 발효 십전대보탕에 함유되어 있는 지표 성분의 함량을 계산 하였다(Table 2).
- plantarum KFRI 144 발효물에서 이들 5종의 성분 변화가 가장 뚜렷하였다. 표준 물질의 tR(retention time) 및 DAD spectrum을 비교 분석하여 2종의 감소한 성분은 liquiritin (2) 및 nodakenin(4)으로 규명하였으며, L. plantarum KFRI 144 동결 건조물에서 용매 분획 및 각종 chromatographic 기술을 이용하여 발효 후 증가한 3종 성분을 분리 정제 후 NMR, MS 분석을 이용하여 cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3), nodakenetin (5)으로 화학 구조를 규명하였다. 또한 이들 증감 성분 5종 에 대하여 십전대보탕 및 8종의 유산균 발효물에 대하여 정량 분석을 수행하여 유산균주별 성분 변화를 관찰하였으며, 다음과 같은 결론을 도출 할 수 있었다.
대상 데이터
- 지표 물질인 uiritigenin, cinnamyl alcohol은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), liquiritin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan), nodakenin은 식품의약품 안전청에서 각각 구입하여 사용하였다.
- HPLC 분석에 사용된 water 및 acetonitrile은 J.T Baker(Phillipsburg, NJ, USA)의 HPLC급 용매를 사용하였다. 지표 물질인 uiritigenin, cinnamyl alcohol은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), liquiritin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Injection volum은 10 µL를 주입하였으며, 파장은 지표 성분의 최대 흡수 파장에 따라 cinnamyl alcohol (1)은 250, liquiritin (2) 및 liquiritigenin (3)은 276, nodakenin (4) 및 nodakenetin (5)은 330 nm에서 분석하였다.
- Open column chromatography 용 C18 powder는 YMC 사의 YMC*Gel ODS-A (particle size 75 µm, YMC Co., Ltd., Japan)를 사용하였다.
- 발효에 사용된 8종의 유산균은(L. casei KFRI 129, L. plantarum KFRI 144, L. curvatus KFRI 166, L. hilgardii KFRI 229, L. delbruekil subsp. lactis KFRI 442, L. casei KFRI 692, L. gasseri KCTC 3163, Bifidobacterium breve KFRI 744) 한국식품연구원(Korea Food Research Institute: KFRI, Seongnam, Korea) 식품미생물 유전자은행에서 분양 받았다. Lactobacillus spp.
- 분석에 사용한 HPLC system은 Elite Lachrom HPLC/DAD system(Hitachi High-Technologies Co., Tokyo, Japan)을 사용하였으며 L-2130 pump, L-2200 auto-sampler, L-2350 column oven, L-2455 diode array UV/VIS detector, EZchrom Elite software(version 3.3.1a)로 구성되어있다. NMR spectrum은 Varian사의 INOVA 600, INOVA 400NB NMR(Varian Co.
- 이 중 F5 분획(300 mg)을 60% MeOH를 유출용매로 하여 C18 open column chromatography를 실시하여 4개의 분획으로 나누었다(F51-F54). 이 중 F52(80 mg) 분획을 prep HPLC(chloroform/methanol, 20:1)를 이용하여 compound 3(2.5 mg)을 얻었고 F54(150 mg)에서는 prep HPLC(n-hexane/ethyl acetate, 1:1)를 이용하여 compound 5(2.0 mg)을 획득하였다. F6 분획(300 mg)에서는 prep HPLC(n-hexane/EtOAc, 7:1)를 반복 실시하여 compound 1(12 mg)을 획득하였다.
- 이들 한약재는 영천약업사(Gyeongbuk Yeongcheon, Korea)에서 구입하였으며 대한약전에 기술된 각각 약재 항목에 적합한 것을 엄선하여 사용하였고, 초고속 진공 저온 약탕기(Cosmos-600, KyungSeo Machine Co., Incheon, Korea)에 한약재와 증류수 24945 mL를 넣고 전탕 추출법으로 115℃ 에서 3시간 열탕 추출한 다음 standard testing sieve(150 µm, Retsch, Haan, Germany)를 이용해 탕액을 여과하였다.
성능/효과
- 2. L. plantarum KFRI 144의 균주로 발효 한 십전대보탕 발효물에서 높은 cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3), nodakenetin (5)의 함량 증가와 liquiritin (2) nodakenin (4)의 높은 분해능을 보여 8종의 십전대보탕 발효물 중 성분변화가 가장 뚜렷하였다.
- 3. L. casei KFRI 129 및 L. casei KFRI 692를 이용하여 발효한 십전대보탕은 liquiritin (2), nodakenin (4)에 대하여 낮은 분해능을 나타내었으며, cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3), nodakenetin (5)의 미약한 함량 증가로 인해 8종의 유산균 발효물 중 가장 낮은 성분 변화를 나타내었다.
- 4. 십전대보탕 구성 약재 중 이들 성분의 기원 약재로는 cinnamyl alcohol (1)은 육계(肉桂, Cinnamomum cassia), liquiritin (2) 및 liquiritigenin (3)은 감초(甘草, Glycyrrhiza glabra), nodakenin (4) 및 nodakenetin (5)은 당귀(當歸, Angelica gigas)로부터 유래됐을 것으로 추정된다.
- 5. 십전대보탕 발효 조건과 같이 십전대보탕을 첨가하지 않은 상태에서 8종의 유산균만을 각각 증식 배양하여 syringe filter(PVDF, 0.45 µm, non-sterile, Advantec MFS Inc., Japan)로 여과 한 후 HPLC 분석을 한 결과 특이 peak가 전혀 없는 것으로 보아 유산균 및 다른 발효 부산물들이 발효 십전대보탕 성분 분석에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 추정된다.
- 발효 후 감소한 성분은 표준품과 HPLC 비교분석(retention time, DAD spectrum)을 통하여 liquiritin (2) 및 nodakenin (4)으로 구조를 규명하였다. 8종의 유산 균주로 발효한 십전대보탕의 성분 변화를 분석한 결과 L. plantarum KFRI 144 발효물이 다른 유산균 발효물에 비하여 cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3) 및 nodakenetin (5) 성분이 대체적으로 가장 높게 증가하였으며, liquiritin (2) 및 nodakenin (4) 성분이 가장 큰 비율로 감소하여 8종의 유산 균주 중 발효 효과가 가장 우수하였다.
- 식품이나 한약재의 발효 중 배당체의 가수 분해로 생성되는 저분자의 aglycone의 증가는 체내의 흡수율 및 생리활성의 증가로 인해 효능이 증가된다고 알려져 있다[7, 13]. 8종의 유산균 발효물에서 liquiritin (2)과 nodakenin (4)의 함량 감소와 이들 배당체의 aglycone인 liquiritigenin (3) 및 nodakenetin (5)의 함량 증가는 발효 중 배당체가 가수분해된다는 사실을 뒷받침한다. 발효 후 cinnamyl alcohol(1)의 증가에 대한 mechanism은 아직 알려져 있지 않다.
- 발효 후 cinnamyl alcohol(1)의 증가에 대한 mechanism은 아직 알려져 있지 않다. 8종의 유산균주로 발효된 십전대보탕의 성분 변화를 관찰한 결과 L. plantarum KFRI 144 발효물이 다른 7종의 발효물에 비하여 가장 뚜렷한 성분 변화를 나타내어 8종의 균주 중 발효 효과가 가장 우수한 것으로 사료된다.
- HPLC/DAD system을 이용하여 십전대보탕 및 8종의 십전대보탕 유산균 발효물을 분석한 결과 전체적으로 8종의 유산균 발효물에서 tR 30.19, 29.21, 28.66 min의 peak가 발효 전과 비교하여 증가 한 것을 관찰하였으며, tR 22.41, 23.26 min의 peak는 감소하였다. 특히 L.
- L. casei KFRI 129로 발효한 십전대보탕의 cinnamyl alcohol 함량은 92.27±0.50 µg/mL(336.6% 증가)로 균주 중 가장 낮은 함량을 나타내었다(Table 2).
- L. casei KFRI 129의 발효물은 84.25±0.10 µg/mL(발효 전 대비 97.5%)로 발효 균주 중 가장 낮은 분해능을 나타내었다(Table 2).
- L. casei KFRI 692는 발효전과 비교하여 84.6% 수준인 37.62±0.50 µg/mL로 발효 균주 중 가장 낮은 분해능을 나타내었다(Table 2).
- L. plantarum KFRI 144 발효물이 24.46±0.32 µg/mL(1972.6% 증가)로 발효물 중 가장 높은 함량을 나타내었으며, L. casei KFRI 692는 0.99±0.17 µg/mL로 발효 균주 중 가장 낮은 분해능을 나타내었으며, 발효 후 함량이 오히려 감소되었다(Table 2).
- L. plantarum KFRI 144로 발효하여 얻어진 발효 십전대보탕의 건조분말 20 g을 물에 suspension하여 ethyl acetate, n-BuOH 순으로 용매 분획 후 이들 용매 분획을 HPLC 분석을 한 결과 발효 후 증가성분이 ethyl acetate 분획에 존재하는 것을 확인하여 ethyl acetate 분획에 대하여 발효 후 증가 성분의 분리를 실시하였다. 우선 ethyl acetate 분획(1.
- L. plantarum KFRI 144의 발효물은 23.08±0.10 µg/mL(2593.3% 증가)으로 발효 균주 중 가장 높은 함량을 나타내었으며, L. casei KFRI 129와 L. casei KFRI 692에 의해 발효된 SJ의 nodakenetin 함량은 0.75±0.01, 0.68±0.03 µg/mL로 발효 후 함량이 오히려 감소하였다(Table 2).
- SJ의 발효 전 liquiritin의 함량은 44.48±0.20 µg/mL이었으 나 발효에 따라 전체 8종의 십전대보탕 발효물에서 liquiritin의 함량이 감소하였으며 L. plantarum KFRI 144 발효물이 발효전과 비교하여 1.8%인 0.81±0.05 µg/mL로 발효 균주 중 가장 높은 분해능을 나타내었다.
- SJ의 발효 전 nodakenin의 함량은 86.39±0.32 µg/mL 이 었으나 발효 후 모든 발효물에서 함량이 감소하였으며, L. plantarum KFRI 144 발효물이 발효전 대비 13.4%인 11.57±0.50 µg/mL로 발효 균주 중 가장 높은 분해능을 나타내었다.
- 발효 후 성분 변화가 가장 뚜렷한 L. plantarum KFRI 144 십전대보탕 발효물 20g으로부터 증가한 3종의 성분을 분리 정제하였으며 1H-, 13C-NMR, MS 및 기존 문헌[16, 1, 10]과 비교하여 compound 1, 3, 5에 대하여 각각 cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3), nodakenetin (5)으로 구조를 규명하였으며, 2종의 감소한 성분은 표준 물질의 HPLC tR(retention time) 및 DAD spectrum을 비교 분석 한 결과 liquiritin (2) 및 nodakenin (4)으로 규명되었다.
- 십전대보탕(SJ)을 발효 하기 전 cinnamyl alcohol의 함량은 27.41±0.12 µg/mL이었으나 발효에 따라 전체 8종의 십전대보탕 발효물에서 cinnamyl alcohol의 함량이 증가하였으며 L. hilgardii KFRI 229 발효물은 357.39±1.50 µg/mL (1303.9% 증가)로 발효 균주 중 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 이상의 결과로 미루어 십전대보탕의 발효에 있어서 발효 균주에 따라 각각의 십전대보탕의 성분 변화가 다르게 나타날 수 있다. 식품이나 한약재의 발효 중 배당체의 가수 분해로 생성되는 저분자의 aglycone의 증가는 체내의 흡수율 및 생리활성의 증가로 인해 효능이 증가된다고 알려져 있다[7, 13].
- 십전대보탕의 발효 전 후 성분 변화를 분석하기 위해 8종의 유산균을 이용하여 발효한 십전대보탕과 발효하지 않은 십전대보탕을 비교 분석하여 발효 후 증가한 3종의 성분과 감소한 2종의 성분을 규명하여 각 유산 균주에 대하여 5종 성분의 정량 분석을 실시하였다. 증가한 3종의 성분은 각종 크로마토그래픽 기술을 이용하여 분리 정제 후 NMR, MS 등의 분광학적 분석기법을 이용하여 구조를 규명하였으며, cinnamyl alcohol (1), liquiritigenin (3) 및 nodakenetin (5)으로 규명되었다. 발효 후 감소한 성분은 표준품과 HPLC 비교분석(retention time, DAD spectrum)을 통하여 liquiritin (2) 및 nodakenin (4)으로 구조를 규명하였다.
후속연구
- 발효 후 증가하는 cinnamyl alcohol (1)는 항당뇨[8] 및 항염증[9] 효과가 알려져 있으며, liquiritigenin (3)은 항암[20], 항염증[6], estrogen receptor[12] 효과가 연구보고 되었다. 따라서 본 연구를 통해 십전대보탕의 발효 후 성분의 변화는 체내 십전대보탕의 흡수율 증가와 효능 강화에 기여를 할 것으로 사료되며, 다양한 발효 한약의 개발 가능성을 제시 할 수 있을 것으로 사료된다.
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