Sipjundaebo-tang was a well-known restorative traditional herbal prescription that used to treat anemia, anorexia, fatigue and inflammation. In this study, we examined the bioconversion of compounds in the Sipjundaebo-tang (SJ) and fermented Sipjundaebo-tang with Lactobacillus fermentum KFRI 164 (FS...
Sipjundaebo-tang was a well-known restorative traditional herbal prescription that used to treat anemia, anorexia, fatigue and inflammation. In this study, we examined the bioconversion of compounds in the Sipjundaebo-tang (SJ) and fermented Sipjundaebo-tang with Lactobacillus fermentum KFRI 164 (FSJ) using established HPLC-DAD method. The chromatogram of FSJ has shown that the contents of six bioactive compounds 5-HMF, paeoniflorin, ferulic acid, cinnam aldehyde, decursin, glycyrrhizin in SJ has decreased. And the contents of unknown compounds (1), (2), (3), (4) and (5) in FSJ were higher than each contents of SJ. The antioxidant activities of SJ and FSJ were conducted by DPPH free radical and Hydrogen peroxide ($H_2O_2$) scavenging assay. Electron donating activity (EDA, %) value of FSJ has shown higher than 21.9% and 14.5% at a concentration of 0.5 mg/ml for DPPH radical scavenging activity and $H_2O_2$ scavenging activity, respectively. Also, the neuroprotective activities of SJ and FSJ against glutamate-induced oxidative stress in a mouse hippocampal cell line (HT22) were evaluated by MTT assay. As a result, FSJ has shown higher neuroprotective activity than 56.5% comparing with SJ. In conclusion, the fermented SJ using microorganism could convert compounds in SJ and enhance antioxidant activity and neuroprotective activity.
Sipjundaebo-tang was a well-known restorative traditional herbal prescription that used to treat anemia, anorexia, fatigue and inflammation. In this study, we examined the bioconversion of compounds in the Sipjundaebo-tang (SJ) and fermented Sipjundaebo-tang with Lactobacillus fermentum KFRI 164 (FSJ) using established HPLC-DAD method. The chromatogram of FSJ has shown that the contents of six bioactive compounds 5-HMF, paeoniflorin, ferulic acid, cinnam aldehyde, decursin, glycyrrhizin in SJ has decreased. And the contents of unknown compounds (1), (2), (3), (4) and (5) in FSJ were higher than each contents of SJ. The antioxidant activities of SJ and FSJ were conducted by DPPH free radical and Hydrogen peroxide ($H_2O_2$) scavenging assay. Electron donating activity (EDA, %) value of FSJ has shown higher than 21.9% and 14.5% at a concentration of 0.5 mg/ml for DPPH radical scavenging activity and $H_2O_2$ scavenging activity, respectively. Also, the neuroprotective activities of SJ and FSJ against glutamate-induced oxidative stress in a mouse hippocampal cell line (HT22) were evaluated by MTT assay. As a result, FSJ has shown higher neuroprotective activity than 56.5% comparing with SJ. In conclusion, the fermented SJ using microorganism could convert compounds in SJ and enhance antioxidant activity and neuroprotective activity.
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제안 방법
14-16) 이에 본 연구에서는 십전대보탕을 발효 균주, Lactobacillus fermentum KFRI 164를 이용하여 발효시킨 후, 확립된 십전대보탕 HPLC 동시 분석법에 적용하여 십전대보탕의 8종 지표성분의 함량 변화를 발효 전과 비교 분석하였다. 8종 지표성분은 십전대보탕을 구성하는 12종의 생약의 지표 성분 중, 5-HMF(숙지황), paeoniflorin(작약), ferulic acid(천궁), cinnamaldehyde(육계), decursinol(당귀), 6-gingerol(생강), decursin(당귀), glycyrrhizin(감초)을 선정하였다(Fig.
30분 간 반응시킨 후, micro plate reader를 사용하여 517 nm에서 OD(optical density) 값을 측정하였다. 17) 십전대보탕의 DPPH free radical 소거활성은 EDA(%)(Electron donating activity)값으로 평가하였다. EDA(%) 값은 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
19,20) HT22 세포의 보호 활성 평가는 glutamate로 인해 유발된 독성에 대한 세포 보호 활성 정도를 측정하는 것으로, MTT assay를 통해 실시하였다. 생쥐 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2, 37oC 배양기에서 배양하였다.
12,13) 또한 쥐를 통한 십전대보탕에 대한 독성 연구결과 안전한 물질로 보고 되었다. 21,22) 본 연구에서는 십전대보탕에 대한 활성을 향상시키기 위한 방법으로 발효균주, Lactobacillus acidophilus KFRI 164를 통해 생물전환하였고 십전대보탕 발효 제제와 비교하여 성분변화, 항산화 활성 및 뇌신경세포 보호 활성이 대해 분석하였다. HPLC-DAD 분석법을 이용하여 SJ와 FSJ의 8종 지표성분의 함량을 비교한 결과, 미생물을 이용한 생물전환에 의해 SJ의 생리활성물질이 새로운 화합물로 전환되거나 생성된 것으로 나타났다.
DPPH free radical 소거법을 실시하여 십전대보탕의 항산화 활성을 평가하였다. 여섯 가지 농도(0.
HT22 세포를 48 well plate에 6.7×104 cells/well로 각 300 µl씩 분주하여 24시간 배양한 후 십전대보탕 시료(10, 100 µg/ml)와 trolox를 30 µl씩 처리하였으며, 1시간 배양 후 glutamate 30 µl씩 처리하였다.
Lactobacillus fermentum KFRI 164를 MRS(de Man, Rogosa and Sharp) broth 배지에 접종한 후 37o C 환경에서 24시간 동안 2회 계대 배양 한 후, 이를 각각의 broth 배지에 접종하여 위와 동일한 환경에서 배양하였다. 초기균를 1~5×107CFU/ml로 맞춰 희석하여 발효균으로 사용하였다.
최적화된 이동상의 조건은 Table I에 제시되어 있다. UV 파장 검출의 각 지표 성분의 최대 UV 흡수 파장 값을 바탕으로 하여 paeoniflorin, 6-gingerol, 그리고 decursin은 230 nm, glycyrrhizin은 254 nm, 5-HMF는 280 nm, ferulic acid, cinnamaldehyde 그리고 decursinol은 300 nm로 설정하여 각 지표 성분의 해당 파장에서의 피크 면적 값을 측정하였다. 분석에 사용된 십전대보탕 시료는 무게를 정확히 칭량하여 60% methanol에 10 mg/ml의 농도로 녹인 후, 0.
1). 그리고 발효에 의한 생물전환 전후의 십전대보탕의 산화적 스트레스에 대한 뇌신경세포 보호 활성 및 항산화 활성을 비교하여 십전대보탕의 효능을 평가하였다.
분석에 사용된 십전대보탕 시료는 무게를 정확히 칭량하여 60% methanol에 10 mg/ml의 농도로 녹인 후, 0.45 µm membrane filter를 사용하여 여과한 뒤 20 µl씩 주입하여 분석하였다.
분석은 SHISEIDO C18 column(5 µm, 250×4.60 mm)을 사용하여 수행되었으며, column의 온도는 35oC를 유지하였다.
25 mM ABTS 용액 30 µl와 1 U/ml의 peroxidase 30 µl를 넣고 37oC에서 10분 간 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 405 nm에서 OD값을 측정하였다. 십전대보탕의 hydrogen peroxide(H2O2) 소거 활성은 EDA(%) 값을 통해 평가하였다.
여섯 가지 농도(0.25, 0.35, 0.50, 0.75, 1.00 그리고 1.25 mg/ml)의 십전대보탕 시료 용액 150 µl에 0.4 mM DPPH 용액 150 µl을 처리하여, 실온의 암실에서 반응시켰다.
인체 내 DNA의 손상 및 세포의 지질과산화를 촉진시켜 노화를 유발하는 것으로 알려져 있는 Hydrogen peroxide의 소거 정도를 측정하여 SJ와 FSJ의 항산화능을 평가하였다(Fig. 4). EDA(%) 값을 비교한 결과 FSJ가 SJ보다 최대 14.
대상 데이터
14-16) 이에 본 연구에서는 십전대보탕을 발효 균주, Lactobacillus fermentum KFRI 164를 이용하여 발효시킨 후, 확립된 십전대보탕 HPLC 동시 분석법에 적용하여 십전대보탕의 8종 지표성분의 함량 변화를 발효 전과 비교 분석하였다. 8종 지표성분은 십전대보탕을 구성하는 12종의 생약의 지표 성분 중, 5-HMF(숙지황), paeoniflorin(작약), ferulic acid(천궁), cinnamaldehyde(육계), decursinol(당귀), 6-gingerol(생강), decursin(당귀), glycyrrhizin(감초)을 선정하였다(Fig. 1). 그리고 발효에 의한 생물전환 전후의 십전대보탕의 산화적 스트레스에 대한 뇌신경세포 보호 활성 및 항산화 활성을 비교하여 십전대보탕의 효능을 평가하였다.
각 지표 성분의 순도는 97% 이상을 나타냈다. HPLC 분석을 위한 water와 methanol은 HPLC용 특급 용매로, trifluoroacetic acid(TFA)는 분석용 등급의 용매로 각각 J.T. Baker(USA)와 (주)대정화금에서 구입하였다.
HT22 cells는 서울대학교로부터 분양 받아 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco (Invitrogen Co., USA)로부터 구입하였다.
분석에 사용된 지표 성분 중에서 hydroxymethylfurfural (5-HMF), ferulic acid 그리고 cinnamaldehyde은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 그리고 6-gingerol, decursin 및 glycyrrhizin은 식품의약품안전청으로부터 확보하였으며, paeoniflorin과 decursinol은 각각 Wako(Japan)와 (주)엘컴사이언스에서 구입하였다. 각 지표 성분의 순도는 97% 이상을 나타냈다.
본 연구에 사용한 HPLC는 Dionex사의 시스템으로, pump(LPG 3X00), auto sampler(ACC-3000), column oven(TCC-3000SD), diode array UV/VIS detector(DAD-3000(RS))로 구성되어있다. 분석은 SHISEIDO C18 column(5 µm, 250×4.
본 연구에 사용한 십전대보탕 시료(3.0 g)와 십전대보탕의 발효에 이용한 균주, Lactobacillus fermentum KFRI 164는 각각 한국한의학연구원과 한국식품개발원으로부터 확보하였다. HT22 cells는 서울대학교로부터 분양 받아 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco (Invitrogen Co.
활성 검색에 사용된 L-glutamic acid monosodium salt hydrate(Glutamate), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT), 2,2-diphenyl-1-pikryl-hydrazyl(DPPH), 2,2-azinobis(3-ethylbenthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbboxylic acid(trolox) 그리고 (+)-sodium L-ascorbate는 모두 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 분석에 사용된 지표 성분 중에서 hydroxymethylfurfural (5-HMF), ferulic acid 그리고 cinnamaldehyde은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 그리고 6-gingerol, decursin 및 glycyrrhizin은 식품의약품안전청으로부터 확보하였으며, paeoniflorin과 decursinol은 각각 Wako(Japan)와 (주)엘컴사이언스에서 구입하였다.
19,20) HT22 세포의 보호 활성 평가는 glutamate로 인해 유발된 독성에 대한 세포 보호 활성 정도를 측정하는 것으로, MTT assay를 통해 실시하였다. 생쥐 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 5% CO2, 37oC 배양기에서 배양하였다. HT22 세포를 48 well plate에 6.
60 mm)을 사용하여 수행되었으며, column의 온도는 35oC를 유지하였다. 이동상으로는 water(A)와 0.1% trifuoroactic acid(TFA) methanol(B)을 이용하였으며, 이동상의 유속은 1.0 ml/min으로 하였다. 최적화된 이동상의 조건은 Table I에 제시되어 있다.
, USA)로부터 구입하였다. 활성 검색에 사용된 L-glutamic acid monosodium salt hydrate(Glutamate), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT), 2,2-diphenyl-1-pikryl-hydrazyl(DPPH), 2,2-azinobis(3-ethylbenthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbboxylic acid(trolox) 그리고 (+)-sodium L-ascorbate는 모두 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다. 분석에 사용된 지표 성분 중에서 hydroxymethylfurfural (5-HMF), ferulic acid 그리고 cinnamaldehyde은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였다.
데이터처리
glutamate에 대한 뇌신경세포 보호 활성은 relative protection(%)로 나타내었다. 통계처리는 ANOVA test를 적용하였다.
이론/모형
SJ와 FSJ의 glutamate에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 HT22 세포의 보호 활성을 평가하기 위하여, MTT assay를 실시하였다. 실험 결과 SJ는 glutamate 단독 처리 대조군과 비교하였을 때 세포 보호 활성을 보이지 않았으나, FSJ는 100 µg/ml에서 56.
십전대보탕의 hydrogen peroxide(H2O2) 소거 활성은 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid(ABTS)-peroxidase 평가법을 사용하여 측정하였다. 18) 여섯 가지 농도(0.
성능/효과
4). EDA(%) 값을 비교한 결과 FSJ가 SJ보다 최대 14.5%(0.5 mg/ml) 더 높은 Hydrogen peroxide 소거 활성을 보였으며, SJ와 FSJ 모두 농도 의존적인 소거 활성을 나타내었다.
21,22) 본 연구에서는 십전대보탕에 대한 활성을 향상시키기 위한 방법으로 발효균주, Lactobacillus acidophilus KFRI 164를 통해 생물전환하였고 십전대보탕 발효 제제와 비교하여 성분변화, 항산화 활성 및 뇌신경세포 보호 활성이 대해 분석하였다. HPLC-DAD 분석법을 이용하여 SJ와 FSJ의 8종 지표성분의 함량을 비교한 결과, 미생물을 이용한 생물전환에 의해 SJ의 생리활성물질이 새로운 화합물로 전환되거나 생성된 것으로 나타났다. 항산화 활성 및 뇌신경세포 보호 활성 평가를 통해 SJ와 FSJ의 생리 활성을 비교 분석하였고, FSJ의 뇌신경세포 보호 활성과 항산화 활성이 SJ보다 증가하였다.
항산화 활성 및 뇌신경세포 보호 활성 평가를 통해 SJ와 FSJ의 생리 활성을 비교 분석하였고, FSJ의 뇌신경세포 보호 활성과 항산화 활성이 SJ보다 증가하였다. 결론적으로 발효 과정을 통한 십전대보탕의 성분 전환으로 인해 십전대보탕의 생리활성이 향상된 것으로 추정된다. HT22 cell에서의 glutmate에 의한 뇌신경세포 사멸의 기전 중 산화적 스트레스에 의한 기전이 보고되었고 항산화 활성의 결과를 통해 발효된 십전대보탕의 ROS 소거능력에 의한 뇌신경세포보호 활성을 나타내는 것으로 판단된다.
8% 감소하였다. 그 밖에도 SJ와 FSJ의 HPLC chromatogram을 비교한 결과 FSJ의 unknown compounds (1), (2), (3), (4), (5)가 SJ과 비교 시 성분 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 근거로 미생물을 이용한 생물전환을 통하여 SJ의 일부 생리활성 물질이 새로운 형태의 화합물로 전환된 것으로 판단된다(Fig.
HPLC-DAD를 이용한 십전대보탕(Sipjundaebo-tang, SJ)과 Lactobacillus fermentum KFRI 164에 의해 발효된 십전대보탕(fermented Sipjundaebo-tang, FSJ)의 8종의 지표 성분 함량의 분석 결과는 Table II에 제시되어 있다. 발효 전 SJ의 지표 성분 함량과 비교하였을 때, FSJ의 8종의 지표 성분 중 decursinol과 6-gingerol을 제외한 6종의 지표 성분의 함량이 7.5~93.8% 감소하였다. 그 밖에도 SJ와 FSJ의 HPLC chromatogram을 비교한 결과 FSJ의 unknown compounds (1), (2), (3), (4), (5)가 SJ과 비교 시 성분 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
5). 본 연구 결과 발효 과정에서 생리활성물질이 전환되거나 생성됨으로써 FSJ가 SJ와 비교 시 높은 세포 보호 활성을 나타나는 것으로 판단된다.
실험 결과 SJ는 glutamate 단독 처리 대조군과 비교하였을 때 세포 보호 활성을 보이지 않았으나, FSJ는 100 µg/ml에서 56.5%의 높은 세포 보호 활성을 나타내었다(Fig. 5).
3에 제시되어 있다. 실험 결과 SJ와 FSJ 모두 농도 의존적인 소거 활성을 보였으며, EDA(%) 값을 비교하였을 때 FSJ가 최대 21.9%(0.5 mg/ml) 더 높은 DPPH free radical 소거 활성을 보였다.
그 밖에도 SJ와 FSJ의 HPLC chromatogram을 비교한 결과 FSJ의 unknown compounds (1), (2), (3), (4), (5)가 SJ과 비교 시 성분 함량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 근거로 미생물을 이용한 생물전환을 통하여 SJ의 일부 생리활성 물질이 새로운 형태의 화합물로 전환된 것으로 판단된다(Fig. 2).
이처럼 본 연구의 free radical 소거 활성 실험에서 FSJ가 SJ보다 높은 항산화 활성을 나타냈다. 따라서 생물전환 과정을 통해 전환된 성분들에 의해 항산화 활성이 증가한 것으로 판단된다.
HPLC-DAD 분석법을 이용하여 SJ와 FSJ의 8종 지표성분의 함량을 비교한 결과, 미생물을 이용한 생물전환에 의해 SJ의 생리활성물질이 새로운 화합물로 전환되거나 생성된 것으로 나타났다. 항산화 활성 및 뇌신경세포 보호 활성 평가를 통해 SJ와 FSJ의 생리 활성을 비교 분석하였고, FSJ의 뇌신경세포 보호 활성과 항산화 활성이 SJ보다 증가하였다. 결론적으로 발효 과정을 통한 십전대보탕의 성분 전환으로 인해 십전대보탕의 생리활성이 향상된 것으로 추정된다.
후속연구
추후 발효된 십전대보탕의 뇌신경세포 보호 기전에 대한 연구를 통해 작용 기전 규명에 대한 연구가 진행되어야 한다. 또한 발효에 의한 생물전환 과정에서 전환 또는 생성되는 지표성분에 대한 명확한 성분 규명과 함께 전환 전·후의 생리활성 변화에 대한 연관성에 관한 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
HT22 cell에서의 glutmate에 의한 뇌신경세포 사멸의 기전 중 산화적 스트레스에 의한 기전이 보고되었고 항산화 활성의 결과를 통해 발효된 십전대보탕의 ROS 소거능력에 의한 뇌신경세포보호 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 추후 발효된 십전대보탕의 뇌신경세포 보호 기전에 대한 연구를 통해 작용 기전 규명에 대한 연구가 진행되어야 한다. 또한 발효에 의한 생물전환 과정에서 전환 또는 생성되는 지표성분에 대한 명확한 성분 규명과 함께 전환 전·후의 생리활성 변화에 대한 연관성에 관한 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
십전대보탕은 원기회복제로 사용할 뿐만 아니라 어느 용도로도 사용되고 있는가?
9,10) 십전대보탕은 이러한 한방제제의 하나로 예로부터 원기회복제로 널리 알려져 있다. 뿐만 아니라 혈액순환을 촉진하며, 식욕부진 및 빈혈 치료제로도 사용되고 있다. 최근에는 산화적 손상에 대한 뇌신경 세포에서의 세포 보호 활성 연구가 보고 되어 있다.
Glutamate란 무엇인가?
Glutamate는 중추신경계의 주요 흥분성 신경전달물질(excitatory neurotransmitter)로 뇌가 손상을 받으면 glutamate는 세포 내 유입이 감소되고 상대적으로 세포 외 농도가 증가하게 된다. Glutamate의 농도가 증가함에 따라 독성이 유발되면서 경쟁적으로 cysteine의 흡수가 억제된다.
십전대보탕은 무엇으로 구성되어 있는가?
최근에는 산화적 손상에 대한 뇌신경 세포에서의 세포 보호 활성 연구가 보고 되어 있다. 11-13) 대한약전외한약 생약 규격집에 따르면 십전대보탕은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 백출(Atractylodes japonica Koidz.), 복령(Poria cocos Wolf), 당귀(Angelica gigas Nakai), 천궁(Cnidium officinale Makino), 숙지황(Rehmannia glutinosa), 생강(Zingiber officinale Roscoe), 대추(Zizyphus jujube var. inermis Mill.), 작약(Paeonia lactiflora Pall.), 황기(Astragalus membranaceus Bunge), 육계(Cinnamomum cassia Blume.), 그리고 감초(Glycyrrhiza glabra L.)로 구성되어있다.
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