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문제 정의
- 염증 신호기작을 활성화시킨다. 따라서 과도하게 생성된 이 물질들에 대한 저해 효과를 살펴봄으로써 항염증 효능을 확인할 수 있다. 본 실험에서 FE가 NO와 PGE2의 생성에 미치는 효과를 살펴본 결과, 세포독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 FE(0.
- 본 실험에서는 LPS로 활성화된 Raw264.7 cell에서의 NO 및 사이토카인 생성에 미치는 영향과 이러한 염증 매개물질의 발현에 핵심적 역할을 하는 NF-κB 신호전달 기작을 조사함으로써 FE의 항염증 효능을 살펴보고자 하였다.
- 본 연구에서는 FE의 항염증효과를 평가하기 위하여, LPS 로 활성화된 Raw264.7 cell에서 발효한약재의 전처치가 염증 매개 물질에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. 그 결과, 발효한 약재는 LPS로 유도된 NO와PGE2의 생성을 유의하게 저해하였을 뿐만 아니라 염증매개 사이토카인인 TNF-α, Ⅱ.
- 본 연구에서는 LPS로 자극한 Raw264.7 cell에서 FE의 항염증 효과를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- Cell에 FE를 농도별로 처치한 후에 배양배지는 걷어내고 well당 50µl의 MTT(0.1 mg/ml)시약을 넣고 4시간 동안 처리하여 생성된 dark formazan crystals을 dissolving solution (DMSO)에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader(Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다21). 세포생존율은 control cell에 대한 백분율로 나타내었다.
- Total cell lysate 및 핵분획물은 30~50µg의 단백질 양으로 취하여 10% gel의 전기영동으로 단백질을 분리하였고 nitrocellulose membrane으로 이전하였다. Nitrocellulose membranee iNOS, COX-2, IκB, NF-κB, Actin, Lamine A/C 등의 1차 antibody를 가하여 반응시킨 후에 2차 antibody 로 처리하였다. 면역반응성 단백질은 ECL chemiluminescence detection kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 확인하였다.
- Raw264.7 cell을 LPS(1µg/ml)로 activation하여 생성된 NO는 세포 배양액 중에 존재하는 nitrite ion(NO2 -)의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면 세포배양 상등액 50µl와 Griess시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid+1% α-naphthylamide in H2O) 50 µl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader(Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
- 7 cell을 LPS(1µg/ml)로 activation하여 생성된 NO는 세포 배양액 중에 존재하는 nitrite ion(NO2 -)의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면 세포배양 상등액 50µl와 Griess시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid+1% α-naphthylamide in H2O) 50 µl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader(Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였다.
- 단백질 농도는 Micro BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 570nm에서 흡광도로 측정하였고 bovine serum albumin (BSA)를 표준물질로 하여 standard curve를 작성한 후에 표준곡선에 따라 정량하였다. Total cell lysate 및 핵분획물은 30~50µg의 단백질 양으로 취하여 10% gel의 전기영동으로 단백질을 분리하였고 nitrocellulose membrane으로 이전하였다.
- 공급받았다. 대두, 홍삼, 진피로 구성된 발효 분말을 준비하기 위해 대두는 삶아서 42~45℃의 온도를 유지하는 발효실에 넣고 48시간 1차 발효시킨 후, 대두의 5~10 중량%가 되도록 홍삼 분말을 혼합하여 25시간 2차 발효시켰다. 대두와 홍삼 혼합 발효물은 진피 분말을 25:75중량비로 혼합하여 18시간 동안 3차 발효한 후에 제분(80 mesh)하였다.
- 대두, 홍삼, 진피로 구성된 발효 분말을 준비하기 위해 대두는 삶아서 42~45℃의 온도를 유지하는 발효실에 넣고 48시간 1차 발효시킨 후, 대두의 5~10 중량%가 되도록 홍삼 분말을 혼합하여 25시간 2차 발효시켰다. 대두와 홍삼 혼합 발효물은 진피 분말을 25:75중량비로 혼합하여 18시간 동안 3차 발효한 후에 제분(80 mesh)하였다.
- Nitrocellulose membranee iNOS, COX-2, IκB, NF-κB, Actin, Lamine A/C 등의 1차 antibody를 가하여 반응시킨 후에 2차 antibody 로 처리하였다. 면역반응성 단백질은 ECL chemiluminescence detection kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 확인하였다.
- 본 실험에서 FE는 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해하는 효과를 나타냈기 때문에 NF-κB의 신호전달계에 연관이 있을 것으로 사료되어 western blot을 실시하여 IκBα와 NF-κB 단백질 발현량을 조사하였다. IκBα의 단백질 발현은 LPS 처리에 의해 세포내에서 급격하게 감소하였으나, FE에 의해 그 감소 정도가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 실험에 사용할 FE의 최적 농도를 결정하기 위하여 농도별로 대식세포에 처치하여 48시간 동안 배양한 후에 MTT로 4시간 동안 반응시켜 세포독성을 조사하였다. FE는 100µg/ml부터 2배씩 희석하여 2.
- 1A). 이에, 저농도 범위에서 세포독성을 유발하지 않는 농도 범위를 조사하였으며, Fig. 1B에서 나타난 결과로부터 발효한 약재 주정추출물이 세포독성을 유발하지 않는 농도로 0.3, 1, 3µg/ml을 결정하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였고, DMEM, fetal bovine serum (FBS), antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Actin, lamin A/C 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Bergheimer, Germany)에서 구입하였고, iNOS, COX-2, IκBα, NF-κB 항체는 Cell Signalling Technology (Irvine, CA, USA)에서 구입하였다.
- Lipopolysaccharide (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoleum (MTT) 는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, DMEM, fetal bovine serum (FBS), antibiotics는 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Actin, lamin A/C 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Bergheimer, Germany)에서 구입하였고, iNOS, COX-2, IκBα, NF-κB 항체는 Cell Signalling Technology (Irvine, CA, USA)에서 구입하였다.
- Murine macrophage cell line인 Raw264.7 cellse 한국세포주연구재단(Seoul, Korea)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100U/ml penicillin 및 100 µg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 모든 실험과정의 세포는 80~90%의 confluence에서 실험하였고, 15 passages를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다.
- 대두, 홍삼, 진피로 구성된 발효 추출물은 주정(95% ethyl alcohol)을 사용하여 준비하였다. 먼저 발효 분말 1kg 당 10L의 주정에 담궈 72시간 동안 추출하여 filter paper (Watman, No.
- 7 cellse 한국세포주연구재단(Seoul, Korea)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100U/ml penicillin 및 100 µg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 모든 실험과정의 세포는 80~90%의 confluence에서 실험하였고, 15 passages를 넘기지 않은 세포만 실험에 사용하였다.
- 아래에 기술한 바와 같이 대두에 홍삼과 진피를 혼합하여 Bacillus Subtilis로 발효시킨 분말은 경북 포항에 위치한 (주)바이오빈P&F에서 공급받았다. 대두, 홍삼, 진피로 구성된 발효 분말을 준비하기 위해 대두는 삶아서 42~45℃의 온도를 유지하는 발효실에 넣고 48시간 1차 발효시킨 후, 대두의 5~10 중량%가 되도록 홍삼 분말을 혼합하여 25시간 2차 발효시켰다.
- 핵 속에 존재하는 NF-κB 단백질 발현을 조사하기 위한 nuclear fractione 시판되는 nuclear extraction kit (Chemicon International, Temecula, CA, USA)를 사용하여 준비하였다.
데이터처리
- 연구 결과는 SPSS system(Statistical Package, SPSS Inc. USA)을 이용하여 ANOVA test 및 LSD로 p<0.05 수준에서 시료간의 유의성을 검정하였고, 모든 data는 평균± 표준편차(mean±SD)로 나타내었다.
이론/모형
- Cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6)은 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은 manufacturer's instruction에 따라 수행하였다. 배양배지는 수거하여 cytokine으로 coating된 96 well plate에 배지를 50µl 씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 배양하였다.
- LPS로 증가된 NO 및 PGE2에 대한 FE의 억제효과가 이들을 생성하는 효소의 단백질 발현 감소에 기인하는지를 조사하기 위하여 western blot analysis를 실시하였다. iNOS와 COX-2는 정상상태에서는 존재하지 않고 LPS에 의해 유도되는 inducible enzyme으로서 대조군에서는 단백질 발현이 관찰되지 않았지만 LPS 처치에 의해 뚜렷하게 증가되었다.
성능/효과
- 1. LPS에 의해 과도하게 생성된 NO 및 PGE2는 FE (0.3, 1, 3µg/ml) 처리에 의해 유의하게 감소되었다.
- 2. FE에 의한 NO 및 PGE2 분비 감소 효과는 이 물질들을 생성하는 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 감소로부터 기인하는 것으로 나타났다.
- 3. LPS에 의해 과도하게 생성된 염증매개 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IL-1β)은 FE에 의해 유의하게 감소되었다.
- 4. FE의 처리는 세포질 내 IκBα의 발현은 증가시키고, NF-κB의 핵으로의 이동을 유의하게 감소시킴으로써 염증 신호전달경로를 차단시켰다.
- 발현량을 조사하였다. IκBα의 단백질 발현은 LPS 처리에 의해 세포내에서 급격하게 감소하였으나, FE에 의해 그 감소 정도가 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 그리고 핵분획에서의 NF-κB는 LPS 처치에 의해 유의하게 증가하였으나, FE에 의하여 NF-κB량이 유의성있게 (p<0.
- 4). TNF-α는 1, 3µg/ml의 농도에서 유의한 억제효과가 나타났으며(Fig. 4A), IL-1β와 IL-6의 분비는 실험에 사용한 전농도 (0.3, 1, 3µg/ml)에서 유의하게 감소되었다(Fig. 4B, C).
- 5A). 그리고 핵분획에서의 NF-κB는 LPS 처치에 의해 유의하게 증가하였으나, FE에 의하여 NF-κB량이 유의성있게 (p<0.01) 감소하였다. FE의 단독 처치에 의한 IκBα 및 NF-κB의 발현량 변화는 관찰되지 않았다(Fig.
- 7 cell에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 포함하는 염증 매개 사이토카인들은 LPS 자극에 의해 과도하게 생성되어 다양한 경로의 염증반응을 촉매하게 된다. 따라서 FE가 이러한 사이토카인의 과도한 생성에 미치는 영향을 살펴본 결과, FE는 염증매개 사이토카인에 대해 유의한(p<0.01) 억제 효과를 보였다(Fig. 4). TNF-α는 1, 3µg/ml의 농도에서 유의한 억제효과가 나타났으며(Fig.
- 따라서 과도하게 생성된 이 물질들에 대한 저해 효과를 살펴봄으로써 항염증 효능을 확인할 수 있다. 본 실험에서 FE가 NO와 PGE2의 생성에 미치는 효과를 살펴본 결과, 세포독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 FE(0.3, 1, 3µg/ml)는 농도의존적으로 저해 효과를 나타내었다(Fig. 2). NO는 LPS 단독 처리군에서 대조군 (CON)에 비해 3.
- IκBα가 떨어져 나가 자유로워진 NF-κB는 핵으로 전위하여 COX-2, iNOS 및 사이토카인 등의 전사를 유도하게 된다32). 본 연구에서 세포질 IκBα 단백질의 발현은 LPS에 의해 감소하였으나 발효한약재에 의해 회복되었다. 핵분획에서의 NF-κB는 LPS에 의해 증가되었고 발효한약재에 의해 감소하였다.
- 핵분획에서의 NF-κB는 LPS에 의해 증가되었고 발효한약재에 의해 감소하였다. 이 결과들은 IκBα의 발현감소로 자유로워진 NF-κB가 핵으로 전위되는 과정을 발효한 약재가 효과적으로 억제하고 있음을 의미한다.
- 이상의 결과로부터 FE가 NF-κB 신호전달경로 차단을 통해 염증매개인자들의 분비를 조절함으로써 항염증효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- iNOS와 COX-2는 정상상태에서는 존재하지 않고 LPS에 의해 유도되는 inducible enzyme으로서 대조군에서는 단백질 발현이 관찰되지 않았지만 LPS 처치에 의해 뚜렷하게 증가되었다. 하지만 iNOS와 COX-2 단백질 발현은 FE에 의해 농도 의존적으로 유의하게(p<0.01) 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). LPS로 유도된 단백질에 대한 expression density를 1로 하였을 때, FE(3µg/ml)에 의해 iNOS는 0.
후속연구
- 29). 발효한약재는 이러한 사이토카인의 생성을 조절함으로써 과잉 작동한 면역시스템에서 유도되는 병적(病的)인 염증반응을 조절하는데 관여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 확인한 FE의 항염증 효과는 발효 과정을 새로이 생성되었거나 함량이 증대된 대사산물들에 기인할 것으로 사료된다. 이미 보고되어진 FE의 항암성 증진 효과도 발효 과정에서 생성된 신규 단백질에 기인하는 것으로 밝혀졌다 20).
- 체내에 바로 흡수될 수 있는 형태의 aglycone 플라보노이드의 함량이 극히 낮은 진피도 장내 미생물에 따른 효소활성의 차이에 의해 흡수되는 정도가 달라지며37), 치마버섯을 이용한 진피 발효 배양물에서는 플라보노이드 배당체가 aglycone 화합물로 생물전환 되어 항산화 및 항염증 효과를 증대시킬 수 있음이 보고되었다38). 본 연구에서 확인된 FE의 활성에 기여한 성분에 대한 이해를 돕기 위해서는 FE의 발효 대사산물에 대한 분석 및 그들이 어떻게 항염증 활성에 상호작용하는지에 대한 후속 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 많이 제한적인 상황이다. 이러한 측면에서 본 실험에 사용된 대두, 홍삼, 진피를 혼합하여 발효시킨 발효 추출물(FE)은 새로운 기능성 소재 탐색의 일례가 될 수 있을 것이다. 김은 이 세가지 약재를 적절한 비율로 배합하여 발효시킴으로써 항암능이 증진될 수 있음을 보여주었다20).
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