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문제 정의
- 최근 산마늘에 대한 생리활성 및 약리효과에 관한 연구는 일부 진행되고 있으나 산지별, 가공 상태별 산마늘의 생리활성에 대한 연구는 많지 않다. 본 연구는 산마늘의 생리활성을 이용한 기능성 고부가가치 소재 개발을 위 한 기초자료를 얻기 위해 울릉도 자연산 산마늘과 강릉 재배 산마늘의 추출물에 대한 항산화활성을 조사하였다.
제안 방법
- 울릉도 자연산은 2009년 4월 울릉도에서 채취한 자연산을, 강릉 재배산은 2009년 5월 강원도 강릉지 역에서 재배한 것을 구입하여 지상부와 지하부로 구분하여 세척한 다음 동결건조기로 동결건조한 후 추출시료로 사용하였다. 추출은 동결건조한 산마늘을 지상부(잎)과 지하부(인경)으로구분하여 냉수(실온), 온수(70。0, 열수(95P 이상)에서 24 시간 추출 및 30%, 50%, 70%, 100% 에탄올로 실온에서 24시간 추출한 다음 여과 후 감압농축기로 농축한 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 5 mL를 갈색병에 첨 가하여 반응액을 조성하여 4(yc 암소에 저장하여 실험에 사용하였다. 4일 간격으로 반응액 0, 1 mL, 75% 에탄올 2.7 mL, 30% ammonium thiocyanate 0.1 mL, 20 mM ferrous chloride (iron(II) chloride tetrahydrate) 0.1 mL를 순서대로 첨가하고 정확히 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 조사하여 산화 정도를 측정하였다. 양성 대조군은 추출물 대신 BHT를 동일 농도로 반응액을 조성하여 실험하였다.
- plafypk矽llum)이 폴리 페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, SOD 유사활성 , 전자공여능, Hydroxy radical 소거 활성, 지질과산화 억제활성 등 항산화활성을 조사하였다. 그 결과 강룽산 재배 산마늘보다 울룽도산 산마늘에서 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타났다.
- 5 mL를 가하여 혼합시켜 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 Griess시 약 대신 증류수 0.1 mL를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하여 추출물을 첨가 한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 소거율을 다음과 같은 공식을 적용하여 백분율(%)로 나타내어 BHT(Butylated hydroxy toluene)처리구와 비교하였다.
- 산마늘 잎과 인경의 물 추출물 및 70% 에탄올 추출물을 1, 000 ppm 농도에서 hydroxy radical 소거능을 즉정하였다(Figure 4). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 20.
- 산마늘 잎과 인경의 물 추출물 및 에탄올 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 지질과산화 억제활성을 조사하였다(Figure 5). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 억제활성이 각각 45.
- 산마늘 추출물을 1, 000 ppm 농도로 하여 전자공여 능을 조사하였다(Fig니re 2). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물에서 39.
- 즉, 에탄올에 용해한 100 hM의 DPPH (1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 900 와 시료 용액 100 卜丄를 혼합하여 잘 교반하고, 이 혼합 시료를 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 수소전자공여능은 각 실험을 3회 반복하여 평균을 낸 다음 대조구에 대한 흡광도의 감소 정도를 다음 식에 의하여 계산하였다.
- 1 mL를 순서대로 첨가하고 정확히 3분 후에 500 nm에서 흡광도를 조사하여 산화 정도를 측정하였다. 양성 대조군은 추출물 대신 BHT를 동일 농도로 반응액을 조성하여 실험하였다. 지질과산화억제율은 아래와 같이 구하였다.
- 울릉도 자연산 산마늘 및 강릉 산마늘 잎과 인경의 물 추출물 및 70% 에탄올 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 플라보노이드 함량을 측정하였다(Table 1). 산마늘 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 플라보이드 함량은 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 12.
- 울릉도 자연산 산마늘 및 강릉 재배 산마늘 잎과 인경의 물 추출물 및 70% 에탄올 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 아질산염 소거능을 측정하였다(Table 2). 산마늘 추출물의 아질산염 소거능은 pH 2.
- 울릉도 자연산 산마늘 및 강릉 재배 산마늘 잎과 인경의 물 추출물 및 70% 에탄올 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 총 폴리페놀 함량을 측정하였다(Fig니此 1). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 경우 총 폴리페놀 함량은 물 추출물 8.
- 울릉도 자연산 산마늘 및 강릉 재배 산마늘의 잎과 인경의 물 추출물 및 70%에탄올 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 Superoxide dism니tase(SOD)활성을 측정하였다(Fig니re 3). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 SOD 유사활성은 물 추출물에서 21.
- 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 mL이 들어 있는 시험관에 시료 1 mL을 가하고 5분이 경과한 다음 5% NaNO, 0.3 mL와 10% A1C1, 0.3 mL를 차례로 가하였다. 대조군은 시료 대신 증류수 1 mL을 가하였다.
- 따라 측정하였다. 희석한 시료 50卩1 에 2.5 mM 2- deoxy-D-ribose를 함유한 10 mM PBS(Phosphate buffered saline)용액 345 卜丄를 혼합한 다음 1 mM FeC^와 1.0 4 mM EDTA 용 액 50 gL, 1 mM ascorbate 50 gL 및 0.1 M H, O, 5 皿를 각각 첨 가하였다. 37。(:에서 10분간 배 양한 후 2.
대상 데이터
- plalyphyllum) 시료는 울릉도 자연산과 강릉 재배산을 사용하였다. 울릉도 자연산은 2009년 4월 울릉도에서 채취한 자연산을, 강릉 재배산은 2009년 5월 강원도 강릉지 역에서 재배한 것을 구입하여 지상부와 지하부로 구분하여 세척한 다음 동결건조기로 동결건조한 후 추출시료로 사용하였다.
- 산마늘 추출에 사용된 ethanol은 Daejung(Korea) 1급 시약을 사용하였으며, 항산화성 분석 시약은 tannic acid (Waco, Japan), hydrogen peroxide(Daejung, Korea), Tris (hydroxymethyl) aminomethane(Merck, Germany), pyrogallol (Yakuri, Japan), 2-thiobabituric acid(Alfe Aesar, USA), linoleic acid(Kanto, Japan)를 사용하였고, 나머지 시 약들은 Sigma(USA)의 제품을 사용하였다. 시료의 동결건조와 농축 장치 는 Eyela(Tokyo, Japan)사의 Freezer dryer FDU- 1200 및 Rotary vacuum evaporator® 사용하였고, 흡광도는 UV-mini-1240 UV spectrometer(Shimadzu, Japan)를사용하여 측정하였다.
- 제품을 사용하였다. 시료의 동결건조와 농축 장치 는 Eyela(Tokyo, Japan)사의 Freezer dryer FDU- 1200 및 Rotary vacuum evaporator® 사용하였고, 흡광도는 UV-mini-1240 UV spectrometer(Shimadzu, Japan)를사용하여 측정하였다.
- plalyphyllum) 시료는 울릉도 자연산과 강릉 재배산을 사용하였다. 울릉도 자연산은 2009년 4월 울릉도에서 채취한 자연산을, 강릉 재배산은 2009년 5월 강원도 강릉지 역에서 재배한 것을 구입하여 지상부와 지하부로 구분하여 세척한 다음 동결건조기로 동결건조한 후 추출시료로 사용하였다. 추출은 동결건조한 산마늘을 지상부(잎)과 지하부(인경)으로구분하여 냉수(실온), 온수(70。0, 열수(95P 이상)에서 24 시간 추출 및 30%, 50%, 70%, 100% 에탄올로 실온에서 24시간 추출한 다음 여과 후 감압농축기로 농축한 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- Values are mean±SD (n=3). Asterisk(*) within the column of the each region are significantly different at **p<0.01 by Student's t-test.
- Values are mean±SD (n=3). Asterisk(*) within the column plant part ofeach different at *p<0.05 by Student's t-test.
- 통계분석은 Students T-test 및 던칸다중검정 (D니ncaHs Mutiple Range Test)을 행하였으며, P<0.05 및 P<0.01 인 경우 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
이론/모형
- Hydroxy radical 소거활성은 Halliwell 등(1987)의 방법에 따라 측정하였다. 희석한 시료 50卩1 에 2.
- SOD(Superoxide dismutase) 유사활성 측정은 Marklund 와 Marklund의 방법 (1974)에 따라 과산화수소(巳。)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성 량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타냈다. 즉, 일정농도의 시료 0.
- 시료 중 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 분광 분석법을 이용하여 측정하였다. 즉, 증류수 4 mL이 들어 있는 시험관에 시료 1 mL을 가하고 5분이 경과한 다음 5% NaNO, 0.
- 시료 추출물을 Choi 등(2006)의 방법에 의 한 수소 전자공여 능(Electron donating activity, EDA)에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 즉, 에탄올에 용해한 100 hM의 DPPH (1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 900 와 시료 용액 100 卜丄를 혼합하여 잘 교반하고, 이 혼합 시료를 암소에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 아질산염 소거능은 Kato 등(1987)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 1 mM의 NaNO, 용액 1 mL에 시료 추출물 1 mg을 첨가하고, 여기에 0.
- 지질과산화 억제활성은 ferric thiocyanate 방법(Haragiichi et al., 1992)으로 하였다. 가용성 고형분 농도를 0.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법 (Folin and Denis, 1915)을 응용하여 측정하였다. 즉, 시료 추출물 1 mg을 95% 에탄올 1 mL에 용해시키고 Folin-Ciocalteau 1 mL 를 첨가하여 幻。C 수욕조에서 혼합하였다.
성능/효과
- 강룽 재배 산마늘보다 울릉도 자연산 산마늘에서 플라보노이드 함량 및 폴리페놀의 함량이 높게 나타났으며, 항산화 활성 또한 높았다. 이러한 결과는 식물종, 유전적, 환경적, 생화학적 요인 뿐만 아니라 온도, 광도 등과 같은 환경적인 요인이 복합적으로 작용한다고 보인다(Kopsell and Kopsell, 2008).
- 70%로 나타나 물 추출물보다 70%에탄올 추출물어]서, 인경보다 잎에서 지질 과산화 억제 활성이 유의성 있게 높았다. 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물 각각 4.91%와 55.15%로 나타났고, 인경 추출물에서는 각각 2.97% 및 52.61%로 나타나 물 추출물보다 70% 에탄올 추출물에서 억제 활성 이유 의성 있게 높았다.
- 20%로 나타나 물 추출물보다 70% 에탄올 추출물에서, 인경보다는 잎에서 hydroxy radical 소거 활성이 유의성 있게 높았다. 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물은 각각 34.23%와 58.85%로 나타났고, 인경의 추출물에서는 각각 15.70% 및 25.75%로 나타나 물 추출물보다 70% 에탄올 추출물에서, 인경보다는 잎에서 hydroxy radical 소거 활성이 유의성 있게 높았으나, 같은 농도의 합성 항산화제인 BHT의 85.73% 보다는 낮았다.
- 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물은 10.13 mg/g, 에탄올 추출물은 10.98 mg/g으로 나타나 용매별 함량은 차이가 없었으며, 인경의 경우 물 추출물 4.38 mg/g, 에탄올 추출물은 3.80 mg/g으로 나타나 용매별 수율은 유의차가 없었다. 다만 부위별로는 인경보다는 잎에서 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났다.
- 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물은 16.36%, 에탄올 추출물은 23.10%로 용매별로 유의 차가 있었으나, 인경의 물 추출물은 17.53%, 에탄올 추출물은 19.27%로 나타나 용매별로 유의차가 없었으며, 부위별로도 유의차가 없었다. 산지별로는 울릉도 자연산 산마늘이 강릉 재배 산마늘보다 유의성 있게 높았다.
- 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물은 48.62%, 에탄올 추출물은 47.67%로 나타나 용매별 함량은 유의차가 없었고, 인경의 물 추출물은 26.44%, 에탄올 추출물은 25.49%로 나타나 용매별 유의차가 없었다. 부위별로는 잎이 인경보다 유의성 있게 높게 나타났다.
- 강릉 재배 산마늘의 물 추출물은 pH 2.5일 때 잎은 19.18%, 인경은 11.09%로, pH 4.2일 때 잎은 7.61%, 인경은 467%로 나타나 pH 2.5일 때 잎에서 유의성 있게 높았다. 에탄올 추출물은 pH 2.
- plafypk矽llum)이 폴리 페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, SOD 유사활성 , 전자공여능, Hydroxy radical 소거 활성, 지질과산화 억제활성 등 항산화활성을 조사하였다. 그 결과 강룽산 재배 산마늘보다 울룽도산 산마늘에서 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타났다. 부위별로는 잎이 줄기보다 높은 함량을 보였다.
- 동일농도와 조건에서 천연 항산화제인 비타민 C의 전자공여 능 47.36%와 비교하면 울릉도 자연산 잎의 에탄올 추출물 및 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물 과 에탄올 추출물의 전자공여능은 천연 항산화제인 비타민 C보다 높은 것으로 나타났다. 이 값은 울릉도에서 채취한 산마늘 생즙의 DPPH 소거능이 100% 생즙의 58% 및 50% 생즙의 34%와 비교하면 거의 유의한 결과를 나타내고 있다 (권정은 등, 2010).
- 부위별로는 잎이 줄기보다 높은 함량을 보였다. 또한 울룽도산 산마늘의 항산화활성은 강릉산 재배 산마늘 보다 같거나 높은 활성을 보였다. 이는 산마늘 이차대사산물의 생합성이 입지환경에 따라 영향을 받음을 알 수 있다.
- , 1992). 본연구 결과에서 울릉도 산마늘 잎의 물 주출물과 에탄올 추출물, 강릉 재배 산마늘 잎과 인경 에탄올 추출물이 BHT 31.70% 보다 높은 지질과산화 억제활성을 나타내 었고, 정향 55.8%, 겨자 46.1%, 고추냉이 40.9%, 계피 33.8%, 후추 20.4% 보다 유사하거나 높은 억제활성을 내고 있어(김 진 등, 2004), 생체내의 지질과산화를 억제하는데 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 함량을 측정하였다(Table 1). 산마늘 추출물의 1, 000 ppm 농도에서 플라보이드 함량은 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 12.83 mg/ g와 73.30 mg/g의 함량을 나타내었고, 강릉 재배 산마늘잎의 에탄올 추출물에서 15.63 mg/g으로, 울릉도 자연산 및 강릉 재배 산마늘의 인경부에서는 0.65 mg/g 미만으로 나타났다 (Table 1).
- 아질산염 소거능을 측정하였다(Table 2). 산마늘 추출물의 아질산염 소거능은 pH 2.5일 때 울릉도 자연산 산마늘 물 추출물은 잎 10.58%로, 인경 20.67%로 나타났고, pH 4.2일 때 잎은 7.28%로, 인경은 3.60%로 나타났으며, 70% 에탄올 추출물은 pH 2.5일 때 잎은 15.80%, 인경은 15.28%로, pH 4.2일 때 잎은 7.52%, 인경은 5.31%로 나타났다.
- 산마늘 추출물의 잎추출물이 줄기 부위보다 플라보노이드 및 폴리페놀 함량이 높게 나타났다. 대부분 식물체의 이차대사산물의 함량은 식물마다 나타난다.
- 다만 부위별로는 인경보다는 잎에서 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났다. 산지별로는 울릉도 자연산 산마늘에서 강릉 재배 산마늘 보다 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났다.
- 32%로 유의차가 없었으며, pH가 낮을수록 아질산염 소거능은 높게 나타났다. 아질산염 소거능은 pH 의존도가 매우 커 산성 영역에 가까울수록 소거능이 높으며 중성에 가까울수록 소거능은 낮아지는 것으로 알려 진 것과 일치하였다.
- 5일 때 잎에서 유의성 있게 높았다. 에탄올 추출물은 pH 2.5일 때 잎은 11.19%, 인경은 11.33%로, pH 42일 때 잎은 9.86%, 인경은 9.32%로 유의차가 없었으며, pH가 낮을수록 아질산염 소거능은 높게 나타났다. 아질산염 소거능은 pH 의존도가 매우 커 산성 영역에 가까울수록 소거능이 높으며 중성에 가까울수록 소거능은 낮아지는 것으로 알려 진 것과 일치하였다.
- 3). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 SOD 유사활성은 물 추출물에서 21.40%, 에탄올 추출물은 92.0%로 에탄올 추출물에서 매우 높았다. 인경의 물 추출물은 26.
- 총 폴리페놀 함량을 측정하였다(Fig니此 1). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 경우 총 폴리페놀 함량은 물 추출물 8.77 mg/g, 에탄올 추출물 52.57 mg/g으로 에탄올 추출물에서 매우 높게 나타났으며, 인경의 경우 물 추출물은 3.09 mg/ g, 에탄올 추출물은 3.67 mg/g로 큰 차이를 보이지는 않았다. 부위별로는 인경보다 잎에서 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났다.
- 4). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 각각 20.97%와 46.43%로 나타났고, 인경은 각각 17.27% 및 25.20%로 나타나 물 추출물보다 70% 에탄올 추출물에서, 인경보다는 잎에서 hydroxy radical 소거 활성이 유의성 있게 높았다. 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물은 각각 34.
- 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물에서 억제활성이 각각 45.26%와 73.33%를 나타내었고, 인경에서는 각각 11.80% 및 26.70%로 나타나 물 추출물보다 70%에탄올 추출물어]서, 인경보다 잎에서 지질 과산화 억제 활성이 유의성 있게 높았다. 강릉 재배 산마늘 잎의 물 추출물과 에탄올 추출물 각각 4.
- 2). 울릉도 자연산 산마늘 잎의 물 추출물에서 39.65%, 에탄올 추출물 55.13%로 에탄올 추출물에서 유의성 있게 높았고, 인경 물 추출물은 19.66%, 에탄올 추출물은 25.17%로 인경 보다는 잎에서 유의성 있게 높게 나타났다(Fig니re 2).
- 위의 결과는 같은 농도에서 합성산화제인 BHT의 pH 2.5에서 45.58%, pH 4.2에서 26.13% 보다 낮았으며, 한약재 열수추출물의 1.0 mg/mL 농도, pH 42에서 산수유 52.98%, 결명자 22.3%, 감국 41.33%, 배초향 32.15%, 뽕나무 잎 48.32%, 두충 27.36%, 오가피 66.19%, 당귀 23.11%, 울금 50.73%(주종찬 등, 2006)오} 비교하면 산마늘은 낮은 값을 나타냈다.
- 이 결과는 다른 약용작물과 비교하면 동일농도에서 백지 17.67%, 맥문동 10.53%, 만삼 10.73%(이양숙 등, 2007) 등과 비교하면 산마늘의 SOD 유사활성은 울릉도 자연 산마늘 70% 에탄올 추출물의 92.0%는 매우 높은 값을 나타내고 있다. 이미 보고된 여러 천연물이나 약용식물보다 높은 SOD유사활성 효과를 나타내고 있어 기능성 항산화 제품으로 개발 가능성이 기대된다.
- 0%로 에탄올 추출물에서 매우 높았다. 인경의 물 추출물은 26.91%로, 에탄올 추출물은 17.21%로 나타났으며, 잎의 에탄올 추출물에서 유의성 있게 높게 나타났다.
후속연구
- 따라서 본 연구 결과 산마늘 잎에는 flavonoid계 항산화 물질이 다량으로 함유되어 있는 것으로 나타나 다양한 생리활성을 이용한 기능성 소재로서 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이는 산마늘 이차대사산물의 생합성이 입지환경에 따라 영향을 받음을 알 수 있다. 본 연구 결과는 산마늘의 유전자원 보존 및 이를 이용한 육종 나아가 건강기능성 소재 개발 등에 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 특히 울룽도산 산마늘은 현재 무분별한 채취에 의해 개체수가 감소하고 있는 산마늘의 품종연구, 증식연구, 보존연구, 임간재배 연구 등에 기초자료가 될 수 있다.
- 0%는 매우 높은 값을 나타내고 있다. 이미 보고된 여러 천연물이나 약용식물보다 높은 SOD유사활성 효과를 나타내고 있어 기능성 항산화 제품으로 개발 가능성이 기대된다. 생체내 항산화 효소 중 하나인 SOD는 세포내 활성산소를 과산화수소로전환시키는 반응을 촉매하는 효소이며 SOD에 의해 생성된 과산화수소는 catalase 또는 peroxidase에 의해 물 분자와 산소분자로 전환되는 중요한 효소 중에 하나이다.
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