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문제 정의
- (홍용표 등, 2006). 따라서 본 연구는 공우성 표지 (codominant DNA marker)인 nSSR 표지 분석을 통하여 구상나무와 분비나무의 유전다양성을 파악하고 두 수종의 유전 분화정도와 유연관계를 알아보고자 수행되었다.
제안 방법
- 각 개체들 별 유전자형 자료를 기초로 다형적 유전자 좌 비율(/>), 유전자좌당 대립유전자의 수(/), 유효 대립유전자의 수(4), 이형접합도 관찰치(丑。), 이형접합도 기대치(乩) 를 계산하였다. 대 립유전자 빈도 분포의 집단간 동질성 검정은 / 검정 및 G 검정에 의해 수행되었으며, Wright의 (1978) 尸 통계치(7危 尸妃와 诉eir(1990)의 방법에 따른 3개의 계층구조(종간, 종내 집단간, 집단내 개체간) 에따른 분화정도를 추정하고 Nei(1972)의 유전적 거리를 구하였다.
- 증폭산물의 분획은 Prism 3130 xL Genetic Analyzer (ABI)를 이용하되, 증폭산물 크기 결정을 위해 Gene Scan™-500 Rox™ size standard를 같이 넣어주었다. 증폭 산물 분석은 Gene Mapper analysis software를 이용하였으며 증폭산물 크기를 기준으로 대립유전자를 확인하고 유전자형을 결정하였다.
- 각 집단 당 20개체를 선발하여 시료를 수집하였으며 개체간 거리는 30 m이상의 간격을 두어 유연관계에 있는 개체가 선발되는 것을 최소화하였다. 채취된 침엽은 일정한 분량(30 mg/개체)을 파쇄기 를 이용하여 분쇄 한 후 DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN 사)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
대상 데이터
- Abies alba3 * * 6^^ 개발된 13개의 nSSR primer (Cremer et al., 2006)를 이용하여 예비실험을 통해 다형성이 관찰된 5개의 primer를 선발하여 사용하였다. 각 primer의 forward sequence의 5'에는 19 bp 길이의 M13 oligonucleotide를 붙여 주어 pcr 과정에서 합성된 DNA template를 이용한 추가적인 DNA 합성과정에 형광 dye FAM/HEX를 붙인 M13 FAM/HEX dye-labeled primer (5'-CACGACGTTG- TAAAACGAC-孑)가 DNA template에 붙게 하였다.
- 구상나무는 3개의 집 단(한라산, 지리산, 덕유산)에서 , 분비나무는 5개의 집단(계방산, 오대산, 설악산, 소백산, 태백산)에서 침엽을 채취하였다. 각 집단 당 20개체를 선발하여 시료를 수집하였으며 개체간 거리는 30 m이상의 간격을 두어 유연관계에 있는 개체가 선발되는 것을 최소화하였다.
데이터처리
- , 1999) 프로그램을 이용하였다. 유전자좌에서의 null allele 존재 유무를 확인하기 위하여 Micro-Checker 프로그램 (Oosterhout et al., 2004)을 이용하였고, 최근의 분포집단감축으로 인한 유전적 부동(genetic drift) 영향 여부를 검증하기 위해서 BOTTLENECK 프로그램(Pity et al., 1999)을 이용하여 Wilcoxon sign-rank test를 통한 유 의성 검증을 실시하였다. 집단 간 유연관계를 분석하기 위해 Nei의 유전적 거리를 기초로 Phylip v3.
- 5(Felsenstein, 1993)를 이용해서 UPGMA법에 의해 Dandrogram을 얻었다. 집단 간 지리적 거리와 유전적 거리에 따른 상관관계를 검증하기 위해서 IBD(Isolation by Distance) 프로그램을 이용하여 Mantel test를 수행했다.
이론/모형
- 계산하였다. 대 립유전자 빈도 분포의 집단간 동질성 검정은 / 검정 및 G 검정에 의해 수행되었으며, Wright의 (1978) 尸 통계치(7危 尸妃와 诉eir(1990)의 방법에 따른 3개의 계층구조(종간, 종내 집단간, 집단내 개체간) 에따른 분화정도를 추정하고 Nei(1972)의 유전적 거리를 구하였다. 이상의 통계 분석은 POPGENE 1.
- , 1999)을 이용하여 Wilcoxon sign-rank test를 통한 유 의성 검증을 실시하였다. 집단 간 유연관계를 분석하기 위해 Nei의 유전적 거리를 기초로 Phylip v3.5(Felsenstein, 1993)를 이용해서 UPGMA법에 의해 Dandrogram을 얻었다. 집단 간 지리적 거리와 유전적 거리에 따른 상관관계를 검증하기 위해서 IBD(Isolation by Distance) 프로그램을 이용하여 Mantel test를 수행했다.
성능/효과
- 223) 보다 높았다(Table 3). 5개 유전자 좌에서 추정된 고정계수(fixation coefficient) 값은 구상나무가 평균 0.111, 분비나무가 평균 0.176로 H-W 평형상태일 때 보다 동형접합체 빈도가 이형접합체보다 빈도보다 높은 것으로 나왔다(Table 5). 동형접합체 빈도가 높게 관찰된 현상에 대해 여러 요인들이 있을 수 있는데 본 연구에 사용된 microsatellite 표지 사용시 null allele들로 인해 실제보다 동형 접합체 가 과다하게 관찰될 가능성이 높을 수 있다고 보고되고 있어(Echt et al.
- 다른 침 엽수종들에 비해 낮은 유전변이를 보유하고 있는 것으로 나타난 구상나무와 분비나무 같은 전나무속 수종은 한대성 수종으로 한반도에서는 플라이토세 빙하기에 한랭한 환경에 적응하면서 제4기 플라이토세 후기에 분포 범위가 확장되었다가 기온이 상승하면서 고산지대로 서식지가 한정 되어 온 것으로 알려져 있다(Kong, 1998). BOTTLENECK 프로그램을 이용하여 Wilcoxon sign-rank test를 통한 유의성 검증을 실시한 결과, 통계적으로 유의한 집단을 관찰할 수 없었다(데이터 미 제시). 따라서 현재 유전변이 분포양상은 최근의 급격한 분포집단 크기 감소에 의해 초래되었다기 보다는 마지막 빙하기까지 생존했던 구상나무와 분비 나무집단들이 빙하기 이후 현재 상태에 이르는 과정에서 저지대 집단들이 개화결실 능력의 약화로 후대 생성에 어려움을 겪음에 따라 서서히 소멸되었고 현존하는 고산지대에 잔존된 집단의 경우에도 집단의 크기가 점진적으로 감소되면서 발생되는 유전적 부동의 영향을 피할 수 없었던 간접증거라고 생각된다.
- 따라서 기존의 연구에서 분석된 표현형상 dominant marker의 특성을 지닌 RAPD 와 ISSR 표지로부터 계산된 수치와 본 연구에서 분석된 codominant marker인 nSSR 표지로부터 계산된 결과를 직접 비교하는 것이 다소 불합리한 면이 있으나 두 수종 간의 유전다양성 정도를 비교해 볼 때 ISSR 표지 분석 결과와 달리 구상나무가 분비나무에 비해 유전다양성이 다소 높은 것으로 나타났다. Codominant 특성을 지 닌 nSSR 표지 가 분석된 다른 침 엽수종의 연구결과를 살펴보면 Picea 沥论s의 유전다양성은 0.815(Maghuly et al., 2006), Pinus sylvestris의 유전다양성은 0.810(Scarfi et al., 2009), Pinus pinaster의 유전다양성은 0.734(Mariette et al., 2001), Picea jezoensis의 유전다양성은 0.406(Moriguchi et al., 2009), Abies ztyuanensise\ 유전다양성은 0.337(Tang et al., 2008)로 보고되어 구상나무와 분비 나무가 다른 침엽수종들에 비해 상대적으로 유전변이가 적게 존재하는 것으로 나타났다. 집단 내 유전변이는 그 집단의 생성 기원이나 지리적 분포 특성, 교배양식의 영향을 받으며 임목의 경우 지리적 분포 범위와 유전다양성이 높은 상관성을 가진다고 알려져 있다(Hamrick et al.
- 침엽을 채취하였다. 각 집단 당 20개체를 선발하여 시료를 수집하였으며 개체간 거리는 30 m이상의 간격을 두어 유연관계에 있는 개체가 선발되는 것을 최소화하였다. 채취된 침엽은 일정한 분량(30 mg/개체)을 파쇄기 를 이용하여 분쇄 한 후 DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN 사)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
- 구상나무의 다형적 유전자좌 비율(F)은 60%~100%로 평균 73.3%, 집단 별 대립유전자 수(/)는 2.8개(한라산) ~3.8개(지리산)로 평균 3.4개, 유효대립유전자 수(&)는 1.7 개(한라산)~2.4개(덕유산)로 평균 2.0개로 나타났다. 이형접합도 기대치(瓦)는 평균 0.
- 01 로 유전분화정도는 1%밖에 차이가 나지 않았다. 기존에 연구된 RAPD 분석결과(구상나무; Gst=0.081, 김인식과 현정오, 2000)와 ISSR 분석결과(구상나무; Gst=0.099, 분비나무; Gst= 0.082, Lee et al., 2008) 보다 다소 낮은 수치이며 분비나무 집단 간 보다 구상나무 집단 간에 유전적으로 더 차이가 나는 것으로 나타났는데 이는 기존의 ISSR 분석결과와 일치하나 그 차이가 더 크게 나는 것을 알 수 있었다. 일반적으로 알려진 임목 집단 간 유전적 차이는 10% 이하로 나타나고 대부분의 유전변이가 집단 간에 공유되고 있다는 기존의 결과와 일치한다(Hong et al.
- 176로 H-W 평형상태일 때 보다 동형접합체 빈도가 이형접합체보다 빈도보다 높은 것으로 나왔다(Table 5). 동형접합체 빈도가 높게 관찰된 현상에 대해 여러 요인들이 있을 수 있는데 본 연구에 사용된 microsatellite 표지 사용시 null allele들로 인해 실제보다 동형 접합체 가 과다하게 관찰될 가능성이 높을 수 있다고 보고되고 있어(Echt et al., 1999, Chapuis and Estoup, 2007), 본 연구에 사용된 모든 유전자 좌에서 확인된 대립유전자들을 대상으로 null allele 존재 유무를 확인한 결과 5개의 유전자좌들 중 SF50 유전자 좌에서만 한라산 집단을 제외한 나머지 집단들 내에 null allele의 존재 가능성이 확인되었고 나머지 유전자 좌에서는 null allele이 확인되지 않았다(데이터 미제시). 그리고유전자좌들 중 SF1과 SF324 에서 고정계수 값이 음의 값을 나타내 거나 0의 값을 나타내고 있어 유전자좌 간 차이가 큰 것으로 나타났다(Table 5).
- 나타났다. 두 수종 간 유전분화 정도는 매우 작게 나타났으며 분비나무 계방산 집단이 구상나무 지리산 집단, 덕유산 집 단과 하나의 분지군을 형성하고 있는 것으로 나타나 이 두 수종의 종 분화가 중분히 이루어지지 못한 것으로 생각된다. 따라서 유전적으로 매우 가까운 구상나무와 분비나무 집단에 대한 보다 구체적인 정보를 수집하기 위해서는 향후 보다 많은 codominant 표지를 대상으로 연구를 수행할 필요가 있다고 생각된다.
- 03). 두 수종의 집단들을 통합하여 유집분석을 수행한 결과 구상나무 한라산 집단이 나머지 구상나무 및 분비나무 집단들로부터 유전적으로 가장 많이 분화된 것으로 나타났다. 분비나무 계방산 집단은 특이하게 나머지 분비나무 집단들과 분리되어 구상나무 덕유산 집단 및 지리산 집단과 단일 분지군을 형성하는 것으로 나타났다.
- 비록 동일한 수종을 대상으로 DNA 변이분석이 이루어지더라도 분석 표지의 종류에 따라 관찰되는 변이체의 특성이 다르고 이들 변이체에 의해서 계산되는 이형접합도의 추정 값들도 달라질 수 있다(홍용표 등, 2006). 따라서 기존의 연구에서 분석된 표현형상 dominant marker의 특성을 지닌 RAPD 와 ISSR 표지로부터 계산된 수치와 본 연구에서 분석된 codominant marker인 nSSR 표지로부터 계산된 결과를 직접 비교하는 것이 다소 불합리한 면이 있으나 두 수종 간의 유전다양성 정도를 비교해 볼 때 ISSR 표지 분석 결과와 달리 구상나무가 분비나무에 비해 유전다양성이 다소 높은 것으로 나타났다. Codominant 특성을 지 닌 nSSR 표지 가 분석된 다른 침 엽수종의 연구결과를 살펴보면 Picea 沥论s의 유전다양성은 0.
- 그러나 본 연구에서는 집단 당 20개체만을 대상으로 분석을 수행했기 때문에 이들 28개 유전자형을 집단별로 모두 관찰하기조차 불가능하다. 따라서 유전자형 sampling errorS 줄이기 위해서 집단 별 대립유전자 수가 과다하게 관찰된 SF50 유전자좌를 제외 하고 나머지 유전자 좌만을 대상으로 집단유전 통계분석을 수행한 결과 구상나무의 다형적 유전자좌 비율(F)은 평균 66.7%, 이형접합도 기대치㈣)는 평균 0.292로 나타났으며, 분비나무의다형적 유전자좌 비율(F)은 평균 60%, 이형접합도 기대치 (貝)는 평균 0220로 나타났다(Table 2, Table 3 등). 구상나무와 분비나무를 대상으로 기존에 수행된 연구에서 RAPD 표지 분석결과 구상나무의 유전다양성 (丑>은 0.
- 그리고유전자좌들 중 SF1과 SF324 에서 고정계수 값이 음의 값을 나타내 거나 0의 값을 나타내고 있어 유전자좌 간 차이가 큰 것으로 나타났다(Table 5). 따라서 집단 당 분석된 20개체에서 관찰된 유전자형 종류가 각 집단에 실제로 존재하는 전체 유전자형에 대한 대표성의 결여로 인해서 야기된 오류일 가능성이 높은 것으로 생각되었다. 일반적으로 집단 내 유전변이량을 정확하게 추정하기 위해서는 생성된 모든 유전자형을 반복적으로 확인할 수 있어야 하는데 nSSR 표지는 유전자좌 당 관찰되는 대 립유전자 수가 다른 표지에 비해 많기 때문에 이들의 조합에 의해서 생성 가능한 유전자형의 수도 많아지게 된다.
- BOTTLENECK 프로그램을 이용하여 Wilcoxon sign-rank test를 통한 유의성 검증을 실시한 결과, 통계적으로 유의한 집단을 관찰할 수 없었다(데이터 미 제시). 따라서 현재 유전변이 분포양상은 최근의 급격한 분포집단 크기 감소에 의해 초래되었다기 보다는 마지막 빙하기까지 생존했던 구상나무와 분비 나무집단들이 빙하기 이후 현재 상태에 이르는 과정에서 저지대 집단들이 개화결실 능력의 약화로 후대 생성에 어려움을 겪음에 따라 서서히 소멸되었고 현존하는 고산지대에 잔존된 집단의 경우에도 집단의 크기가 점진적으로 감소되면서 발생되는 유전적 부동의 영향을 피할 수 없었던 간접증거라고 생각된다. 집단간 유전분화 정도를 나타내는 尸狎값은 0.
- 본 연구를 통해서 기존의 연구결과와 달리 구상나무가 분비나무에 비해 유전다양성이 다소 높은 것으로 나타났으나 두 수종 집단간 유전분화 정도는 분비나무 집단간보다 구상나무 집단간에 유전적으로 더 차이가 나는 것으로 나타났다. 두 수종 간 유전분화 정도는 매우 작게 나타났으며 분비나무 계방산 집단이 구상나무 지리산 집단, 덕유산 집 단과 하나의 분지군을 형성하고 있는 것으로 나타나 이 두 수종의 종 분화가 중분히 이루어지지 못한 것으로 생각된다.
- 두 수종의 집단들을 통합하여 유집분석을 수행한 결과 구상나무 한라산 집단이 나머지 구상나무 및 분비나무 집단들로부터 유전적으로 가장 많이 분화된 것으로 나타났다. 분비나무 계방산 집단은 특이하게 나머지 분비나무 집단들과 분리되어 구상나무 덕유산 집단 및 지리산 집단과 단일 분지군을 형성하는 것으로 나타났다. 이는 두 수종의 불완전한 종분화의 간접적인 증거로 이러한 현상은 계층적 구조에 따른 유전분화 분석결과와 일치하는 것으로 나타났다(Fig니 此 4, Table 6).
- 따라서 현재 유전변이 분포양상은 최근의 급격한 분포집단 크기 감소에 의해 초래되었다기 보다는 마지막 빙하기까지 생존했던 구상나무와 분비 나무집단들이 빙하기 이후 현재 상태에 이르는 과정에서 저지대 집단들이 개화결실 능력의 약화로 후대 생성에 어려움을 겪음에 따라 서서히 소멸되었고 현존하는 고산지대에 잔존된 집단의 경우에도 집단의 크기가 점진적으로 감소되면서 발생되는 유전적 부동의 영향을 피할 수 없었던 간접증거라고 생각된다. 집단간 유전분화 정도를 나타내는 尸狎값은 0.053(구상나무)과 0.049(분비 나무)로 나타났으며 null allele가 관찰된 SF5O을 제외한 4 개의 유전자좌에서 추정된 집단 간 유전분화 정도를 나타내는 尸st값은 0.063(구상나무)과 0.039(분비나무)로 나타나 구상나무의 경우 전체 유전변이 중 6.3%, 분비나무의 경우 3.9% 만이 집단 간 유전적 차이에 기인한 것이고 나머지는 전체 집단 내 개체 간에 공유하는 유전변이에 기인한 것으로 나타났다(Table 5). SF50 유전자 좌를 포함시켰을 때와 포함시키지 않았을 때 尸st값의 차이는 0.
후속연구
- 따라서 유전적으로 매우 가까운 구상나무와 분비나무 집단에 대한 보다 구체적인 정보를 수집하기 위해서는 향후 보다 많은 codominant 표지를 대상으로 연구를 수행할 필요가 있다고 생각된다. 그러나 본 연구에 사용된 nSSR 표지 의 경우 RAPD 표지 나 cpDNA 표지 에 비해 상대적으로 다수의 대 립유전자가 관찰되는 특성이 있으므로 집단 내 분포하는 정확한 유전자형 빈도를 추정하기 위해서는 전체 집단에서 관찰된 대립유전자 수로부터 조합이 가능한 유전자형들이 집단 내 시료에서 충분히 반복될 수 있는 개체수 이상의 시료를 확보해야 될 것으로 생각된다.
- 두 수종 간 유전분화 정도는 매우 작게 나타났으며 분비나무 계방산 집단이 구상나무 지리산 집단, 덕유산 집 단과 하나의 분지군을 형성하고 있는 것으로 나타나 이 두 수종의 종 분화가 중분히 이루어지지 못한 것으로 생각된다. 따라서 유전적으로 매우 가까운 구상나무와 분비나무 집단에 대한 보다 구체적인 정보를 수집하기 위해서는 향후 보다 많은 codominant 표지를 대상으로 연구를 수행할 필요가 있다고 생각된다. 그러나 본 연구에 사용된 nSSR 표지 의 경우 RAPD 표지 나 cpDNA 표지 에 비해 상대적으로 다수의 대 립유전자가 관찰되는 특성이 있으므로 집단 내 분포하는 정확한 유전자형 빈도를 추정하기 위해서는 전체 집단에서 관찰된 대립유전자 수로부터 조합이 가능한 유전자형들이 집단 내 시료에서 충분히 반복될 수 있는 개체수 이상의 시료를 확보해야 될 것으로 생각된다.
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