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문제 정의
- 본 연구는 국내에서 대량 양식되고 있는 방사무늬김(Porprhya yezoensis)에서 추출한 porphyran의 결합 구조를 밝히기 위해 정제 porphyran을 ß-agarase로 가수분해한 후 한외여과막으로 분자량 별로 분획하였다.
제안 방법
- Porphyran의 결합 특성을 조사하기 위해 ß-agarase로 가수분해한 후 ultrafiltration membrane과 이온교환 수지 칼럼으로 분획한 A-3,000 분획물의 13C-NMR을 측정하였다.
- Porphyran의 구조 특성을 조사하기 위해 정제 porphyran을 ß-agarase로 가수분해한 후 ultrafiltration membrane과 이온 교환 수지 칼럼으로 분획하여 각 분획물의 수율과 화학적 조성을 측정하였다(Table 1).
- 그러나 다당은 동일한 구성성분이라도 결합 양식 및 주위에 결합된 구성당에 따라 chemical shift값이 달라진다. 따라서 본 실험에서는 기준 물질로 neoagarohexose (Sigma co.)를 이용하여 구성당의 peak를 assignment한 후 이를 이용하여 A-3,000의 signal을 assignment하였다(Lahaye et al, 1989). Fig.
- 다시 NaOH 10 g과 NaBH4 2 g을 첨가하여 용해시키고 80℃ 온수에 넣어 4시간 동안 가열하였다. 묽은 염산으로 중화하고 48시간 증류수로 투석한 후 동결 건조하여 황산기가 제거된 porphryan (desulfated porphyran)을 제조한 후 화학적 조성을 분석하였다.
- 본 연구는 국내에서 대량 양식되고 있는 방사무늬김(Porprhya yezoensis)에서 추출한 porphyran의 결합 구조를 밝히기 위해 정제 porphyran을 ß-agarase로 가수분해한 후 한외여과막으로 분자량 별로 분획하였다. 분자량 별 분획물을 다시 이온교환 수지 칼럼으로 중성과 극성으로 나누어 수율, 구성당 조성 및 13C-NMR 측정을 하여 porphyran의 결합 구조를 조사하였다.
- 상층액을 molecular weight cut-off이 3,000, 30,000, 300,000인 한외여과막(DIAFLO ultrafiltration membrane, Amicon Division)을 사용하여 분자량 별로 분리한 후 각 분자량 분획물을 Dowex 1×8 이온교환수지 칼럼(200 mesh, 2.0×70 cm)에 주입하고 증류수로 중성 분획물을 용출한 후 2 N NaCl용액으로 극성 분획물을 용출하였다.
- 용출된 분획물을 다시 감압 농축한 후 Bio gel P-2 칼럼 (200 mesh, 1.0×100 cm)으로 탈염한 후 동결 건조하여 분자량이 3,000이하인 중성(N-3,000)과 극성(A-3,000) 분획물, 분자량이 3,000-30,000인 중성(N-30,000)과 극성(A-30,000) 분획물, 분자량이 30,000-300,000인 중성(N-300,000)과 극성(A-300,000) 분획물을 제조하였다.
- 효소 분해하여 얻은 분자량 3,000이하의 N-3,000과 A-3,000을 각각 D2O에 녹여 13C-NMR (125 MHz, Brucker사, AMX500)을 이용하여 실온에서 측정하였다. 핵자기 공명 흡수위치(Chemical shift)는 DMSO를 시료에 첨가하여 측정한 후 TMS (Tetramethylsilane)로 환산하여 나타내었다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 정제 porphyran은 Park and Koo (2008) 방법에 따라 제조하였다. 즉, 경기도 화성군 장안면에서 3월 중순경에 채취하여 건조한 방사무늬김(P. yezoensis)의 열수 추출액에 에탄올을 첨가하여 crude porphyran을 제조한 후 cetylpyridinium chloride와 61-70% 에탄올을 사용하여 정제하였다. 정제 porphyran의 galactose, 3,6-anhydrogalactose, 6-methyl galactose, sulfate의 mole 비는 1.
이론/모형
- 구성당 조성은 Furneaux et al. (1990)의 방법에 따라 acetylation한 후 SP-2330 칼럼(0.25 mm I.D. × 30 m)으로 230℃에서 gas chromatography (HP 6890)로 분석하였다.
- 실험에 사용한 정제 porphyran은 Park and Koo (2008) 방법에 따라 제조하였다. 즉, 경기도 화성군 장안면에서 3월 중순경에 채취하여 건조한 방사무늬김(P.
- 정제 porphyran을 Rees et al. (1961)의 방법에 따라 알칼리 처리하여 황산기를 제거하였다. 즉, 정제 porphyran 1 g을 200 mL의 증류수에 녹인 후 원심분리(5000 g, 15분)하여 분리한 상층액에 NaBH4 200 mg을 가하여 30℃에서 24시간 환원시켰다.
- 황산기의 함량은 Dodgson et al. (1962)의 방법에 따라 분석하였다. 구성당 조성은 Furneaux et al.
성능/효과
- 또한 porphyran 황산기의 86%는 3,6-anhydrogalactose의 전구물질인 6-sulfate galactose로 존재하며 알칼리 처리를 하여 황산기를 제거하면 3,6-anhydro-galctose가 생성된다고 알려져 있다(Rees, 1961). 따라서 본 실험에서 제조한 porpyran도 알칼리 처리시 황산기가 감소하고 3,6-anhydro-galctose가 증가됨을 미루어 볼 때 황산기의 대부분이 C-6에 결합되어 있을 것으로 추정할 수 있다. Desulfated porphyran의 galactose, 3,6-anhydro-galctose, 6-methylgalactose의 mole 비가 1.
- 5%로 분자량이 클수록 수율이 높았다. 또한 전체 중성 분획물의 수율이 극성 분획물의 수율에 비해 높았고 특히 중성 분획물 중 N-3,000의 수율이 23.2%로 현저히 높았다. 이는 극성 분획물에는 황산기가 함유되어 있어 ß-agarase의 활성이 저해되어 가수분해도가 떨어지기 때문으로 생각된다.
- Porphyran의 구조 특성을 조사하기 위해 정제 porphyran을 ß-agarase로 가수분해한 후 ultrafiltration membrane과 이온 교환 수지 칼럼으로 분획하여 각 분획물의 수율과 화학적 조성을 측정하였다(Table 1). 효소 가수분해된 분자량 300,000이하의 porphyran의 총 수율은 43.3%이고, 효소 활성 저항성을 나타내는 300,000이상 고분자 분획물은 28.9%였다. 분자량에 따른 수율은 중성 분획물인 N-3,000이 23.
후속연구
- 76으로 3,6-anhydrogalactose의 비율이 중성 분획물에 비하여 적었으나 원시료인정제 porphyran에 비하여는 높았다. 이상의 porphyran의 효소 분획물의 수율과 화학 조성 결과로 미루어 볼 때 porphyran은 황산기를 함유한 산성 다당 block과 황산기를 함유하지 않은 neoagarose block으로 이루어져 있으며 전체 porphyran에서 중성 block인 neoagrose block이 약 25% 정도이나 neoagarose의 중합도를 측정하기 위해서는 추가 연구가 필요하다고 판단된다.
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