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제안 방법
- 본 연구에서는 현호색을 메탄올로 추출하여 P. acnes에 대한 항균력을 평가하였고, 각 구성화합물의 항균력평가를 통해 항여드름 효능을 지닌 dehydrocorydaline을 선별하였다. 또한 식초에 침지한 후 炒하는 醋炒玄胡索에서 통증완화 효과가 증가된다는 자료에 근거하여15,16) acetic acid로 전처리된 현호색의 炒(roasting) 시간에 따른 항균력과 dehydrocorydaline의 함량 변화를 비교 조사하여 여드름균에 대한 항균능을 최대화할 수 있는 현호색 수치조건을 확립하였다.
- acnes에 대한 항균력을 평가하였고, 각 구성화합물의 항균력평가를 통해 항여드름 효능을 지닌 dehydrocorydaline을 선별하였다. 또한 식초에 침지한 후 炒하는 醋炒玄胡索에서 통증완화 효과가 증가된다는 자료에 근거하여15,16) acetic acid로 전처리된 현호색의 炒(roasting) 시간에 따른 항균력과 dehydrocorydaline의 함량 변화를 비교 조사하여 여드름균에 대한 항균능을 최대화할 수 있는 현호색 수치조건을 확립하였다.
- 醋炒玄胡索의 제조에는 건조중량대비 10~40%의 식초량을 사용함15)에 근거하여 본 연구에서는 중량의 30%에 해당하는 acetic acid를 사용하였으며, 일반적으로 식초의 산도가 7%이하인 점을 고려하여 5% acetic acid에 12시간 동안 침지한 후 음건하였다. Acetic acid가 처리된 현호색은 250℃로 온도가 유지되는 팬 위에 올려 골고루 저어 주면서 정해진 시간 (0, 5, 10, 15, 20, 30분) 동안 炒하였다.
- 에 근거하여 본 연구에서는 중량의 30%에 해당하는 acetic acid를 사용하였으며, 일반적으로 식초의 산도가 7%이하인 점을 고려하여 5% acetic acid에 12시간 동안 침지한 후 음건하였다. Acetic acid가 처리된 현호색은 250℃로 온도가 유지되는 팬 위에 올려 골고루 저어 주면서 정해진 시간 (0, 5, 10, 15, 20, 30분) 동안 炒하였다. 수치 처리된 현호색은 건조중량으로 200 g을 취하여 메탄올 1 ℓ에 72시간 침지하여 추출한 후 여과 및 농축하였다.
- 디스크 확산법에 의한 생육저해환을 측정하기 위하여 BHI agar plate를 사용하였다. P.
- acnes 균주는 24시간 동안 전 배양하여 107~108 CFU/㎖의 농도로 준비하여 45℃로 유지된 top agar 5 ㎖에 1 ㎖씩 가하여 잘 혼합한 후, BHI agar plate에 도말하였다. 추출물은 0.25, 0.5, 1.0 ㎎/25 ㎕의 농도로 준비하여 8㎜ 직경의 paper disc위에 25 ㎕씩 올리고 대조구 (control) disc 위에는 DMSO를 25 ㎕ 적셨다. Top agar가 마른 후에 BHI agar plate 위에 추출물이 적셔진 disc를 올리고 혐기성배양조건(5% H2, 95% N2; 37℃)에서 배양하였다.
- 24시간 배양 후에 생성된 생육저해환은 micrometer(Mitutoyo, Kawasaki, Japan)를 이용하여 측정하였다. 현호색 구성화합물의 경우, 1, 10, 100 ㎍/25 ㎕/disc의 농도로 실험하였다.
- 배양된 균은 분광광도계(TECAN, Crailsheim, Germany)를 사용하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 107 CFU/㎖의 농도로 준비하여 96well plate에 200 ㎕씩 분주하였다. 현호색 추출물은 최고농도를 500 ㎍/㎖으로 하여 2배씩 series로 희석(stepwise 2-fold dilution)하여 0.5 ㎍/㎖까지 희석하였다. 현호색의 구성화합물은 200 ㎍/㎖부터 0.
- 현호색 추출물 및 구성화합물들은 시험균주가 접종된 96well plate에 첨가하여 혐기성배양조건에서 배양하였다. 24시간 배양 후에, 분광광도계로 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였고 P. acnes의 생육이 억제된 최저의 농도를 최소저해농도로 결정하였다.
- 각 시간별로 roasting하여 수치된 현호색은 C18 column(2.1☓100㎜, Waters)을 사용하여, 용매 A(0.1% formic acid in water)와 용매B(0.1% formic acid in acetonitrile)를 기울기 변화로 흘려보내면서 AcQUITY UPLCTM System(Waters, UK)으로 분석하였다.
- 5 ㎜의 생육저해환을 형성하였다(Table 1). 현호색 구성화합물 중에서 여드름균에 항균능을 지닌 화합물을 선별하기 위해 시판되는 4종의 화합물(dehydrocorydaline, corydaline, tetrahydropalmatine, protopine)을 구입하여 1, 10, 100 ㎍/disc의 농도로 처리하여 혐기조건에서 24시간 배양 후 생성된 생육저해환을 측정하였다. Corydaline, tetrahydropalmatine, protopine에서는 여드름 균에 대한 항균능이 관찰되지 않았으나, dehydrocorydaline은 100 ㎍/disc의 농도에서 20.
- 최소저해농도(MIC) 측정을 위해 현호색 추출물은 500 ㎍/㎖부터 0.5 ㎍/㎖까지, dehydrocorydaline은 200 ㎍/㎖부터 0.5 ㎍/㎖까지 2배씩 series로 희석하여 P. acnes에 처리하였다. P.
- acnes에 처리하였다. P. acnes균은 24시간 동안 혐기조건에서 배양하였고, 600 ㎚에서 흡광도를 측정하여 균의 생육이 억제된 최저의 농도를 MIC로 결정하였다. 그 결과, 현호색 추출물은 62.
- 5% acetic acid 전처치와 炒를 통해 수치된 현호색과 일반 normal 현호색의 항균력을 비교하였다. 농도는 0.
- 수치 현호색에서 여드름균에 대한 항균력이 증가되는 것이 현호색의 구성화합물 중 유용성분으로 선별된 dehydrocorydaline(Fig. 1B, Table 2 and 3)의 함량 변화에 기인하는지를 조사하기 위하여, 무처리한 현호색과 각 시간별 수치 현호색으로 부터 dehydrocorydaline 성분 함량을 UPLC로 분석하였다. 그 결과 항균력이 증가된 5분, 10분간 炒한 현호색에서 dehydrocorydaline의 함량이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig.
- acnes에 대해 강력한 항균효과를 지님을 확인하였다. 더불어 수치 현호색과 무처치 현호색의 항균활성과 구성 화합물의 성분 변화를 비교 평가하였으며, 이를 바탕으로 유용 항균성분이 증가되는 현호색의 수치조건을 확립하였다. 5% acetic acid로 침지하고, 炒과정을 거친 수치 현호색(醋炒玄胡索)은 무처리된 현호색에 비해 유의하게 증가된 항균활성을 보였다.
- 현호색 및 醋炒玄胡索을 메탄올로 추출하여 여드름균인 P. acnes 균에 대한 항균활성을 비교 평가한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 현호색을 10분으로 炒하였을 때 현호색의 항균능이 가장 우수하였으므로, 10분간 炒한 현호색의 농도별 항균활성을 조사하였다. 그 결과 실험에 사용된 모든 농도(0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 현호색은 약업사(대원, 대구)에서 구입하여 물로 세척하고 음건한 후 사용하였고, 현호색의 구성화합물인 dehydrocorydaline, corydaline, protopine, tetrahydropalmatine은 Wako chemicals(Osaka, Japan)사에서 구입하였다.
- P. acnes KCCM 41747은 한국미생물보존센터로부터 분양받아 BHI broth(Difco, USA)에 배양하였고 배양된 균은 glycerol과 3:7의 비율로 잘 혼합하여 -70℃에 보관하였다. 냉동고에 보관된 균주는 실험시작 3일 전에 활성화 시킨 후 BHI agar plate에 접종하여 5% H2와 95% N2가 공급되는 혐기성 배양기(Vision Scientific Co.
- acnes KCCM 41747은 한국미생물보존센터로부터 분양받아 BHI broth(Difco, USA)에 배양하였고 배양된 균은 glycerol과 3:7의 비율로 잘 혼합하여 -70℃에 보관하였다. 냉동고에 보관된 균주는 실험시작 3일 전에 활성화 시킨 후 BHI agar plate에 접종하여 5% H2와 95% N2가 공급되는 혐기성 배양기(Vision Scientific Co., LTD, Korea)에서 배양하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 윈도우용 SPSS 17.0을 사용하여 oneway ANOVA, Turkey test(multiple comparison)방식으로 분석하였으며, P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
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