감귤은 국내 및 동남아시아 지역에서 많이 즐기는 식품 중 하나이며, 이러한 감귤류의 껍질을 건조시킨 것을 진피라고 한다. 이러한 진피는 한방에서는 이뇨작용, 비장기능을 강화하는 것으로 알려져 있으나, 천연 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 학계에서 여러 분야로 연구가 되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 플라보노이드 배당체를 함유한 진피 추출물을 ${\beta}$-glucosidase 효소를 이용하여 아글리콘(aglycone)으로 변환 할 수 있도록 치마버섯 배양을 실시하였다. 진피 발효 배양액을 HPLC를 이용하여 분석하였으며, UVA에 의한 광손상 보호능을 섬유아세포를 이용하여 측정하였다. 진피 발효 배양액은 COX-2, LOX-5와 같은 항염증 관련 대사에도 관여하여 염증완화에도 도움을 줄 수 있음을 확인하였다. 또한 각질 형성세포를 이용한 interleukin-$1{\alpha}$를 측정한 결과 진피발효배양액 처리군의 저해활성이 더 높았다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 진피발효 배양액은 피부에 대한 항염 및 항산화 효과가 우수한 것으로 사료된다.
감귤은 국내 및 동남아시아 지역에서 많이 즐기는 식품 중 하나이며, 이러한 감귤류의 껍질을 건조시킨 것을 진피라고 한다. 이러한 진피는 한방에서는 이뇨작용, 비장기능을 강화하는 것으로 알려져 있으나, 천연 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 학계에서 여러 분야로 연구가 되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 플라보노이드 배당체를 함유한 진피 추출물을 ${\beta}$-glucosidase 효소를 이용하여 아글리콘(aglycone)으로 변환 할 수 있도록 치마버섯 배양을 실시하였다. 진피 발효 배양액을 HPLC를 이용하여 분석하였으며, UVA에 의한 광손상 보호능을 섬유아세포를 이용하여 측정하였다. 진피 발효 배양액은 COX-2, LOX-5와 같은 항염증 관련 대사에도 관여하여 염증완화에도 도움을 줄 수 있음을 확인하였다. 또한 각질 형성세포를 이용한 interleukin-$1{\alpha}$를 측정한 결과 진피발효배양액 처리군의 저해활성이 더 높았다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 진피발효 배양액은 피부에 대한 항염 및 항산화 효과가 우수한 것으로 사료된다.
Citrus unshiu (C. unshiu) Markovich were dried peel of mandarin orange, of which fresh fruit was one of the famous foods in Korea and Eastern Asia. In the oriental medicine, C. unshiu peel was known to have a diuretic effect and to strengthen spleen function. Recently, natural flavonoids of C. unshi...
Citrus unshiu (C. unshiu) Markovich were dried peel of mandarin orange, of which fresh fruit was one of the famous foods in Korea and Eastern Asia. In the oriental medicine, C. unshiu peel was known to have a diuretic effect and to strengthen spleen function. Recently, natural flavonoids of C. unshiu peel have been investigated. In this study, C. unshiu peel extract containing flavonoid-glycosides was cultured with Schizophyllum commune (S. commune) mycelia producing ${\beta}$-glu- cosidase and its biological activities were investigated. ${\beta}$-glucosidase of S. commune mycelia converted the flavonoid-glycosides (rutin and hesperidin) into aglycones (naringenin and hesperetin). Fermented C. unshiu peel extract compounds were analyzed by HPLC system. The photoprotective potential of fermented C. unshiu peel extract was tested in human dermal fibroblasts (HDFs) exposed to UVA. Fermented C. unshiu peel extract extract also showed notable in vitro anti-inflammatory effect on cellular systems generating cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) metabolites. Also, UVB-induced production of interleukin-$1{\alpha}$ in human HaCaT cells was reduced in a dose-dependent manner by treatment with fermented C. unshiu peel extract. These results suggest that fermented C. unshiu peel extract may mitigate the effects of photoaging in skin by reducing UV-induced adverse skin reaction.
Citrus unshiu (C. unshiu) Markovich were dried peel of mandarin orange, of which fresh fruit was one of the famous foods in Korea and Eastern Asia. In the oriental medicine, C. unshiu peel was known to have a diuretic effect and to strengthen spleen function. Recently, natural flavonoids of C. unshiu peel have been investigated. In this study, C. unshiu peel extract containing flavonoid-glycosides was cultured with Schizophyllum commune (S. commune) mycelia producing ${\beta}$-glu- cosidase and its biological activities were investigated. ${\beta}$-glucosidase of S. commune mycelia converted the flavonoid-glycosides (rutin and hesperidin) into aglycones (naringenin and hesperetin). Fermented C. unshiu peel extract compounds were analyzed by HPLC system. The photoprotective potential of fermented C. unshiu peel extract was tested in human dermal fibroblasts (HDFs) exposed to UVA. Fermented C. unshiu peel extract extract also showed notable in vitro anti-inflammatory effect on cellular systems generating cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) metabolites. Also, UVB-induced production of interleukin-$1{\alpha}$ in human HaCaT cells was reduced in a dose-dependent manner by treatment with fermented C. unshiu peel extract. These results suggest that fermented C. unshiu peel extract may mitigate the effects of photoaging in skin by reducing UV-induced adverse skin reaction.
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문제 정의
비배당체로의 전환은 기존보다 향상된 생리활성을 가지는 결과가 보고되고 있다. 본 연구에서는 진피를 이용한 발효 배양물을 제조하여 항산화 효과 및 항염 효과를 측정하여 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
COX-2 억제효능은 Reddy 등의 방법을 변형하여 in vitro에서 수행하였다[13]. 96 well plate에 40 units/mL의 COX-2를 40 μL씩 넣고, 100 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
각질형성세포를 자외선 조사기(UVB G15T8E, Sankyo Denki, Japan)로 10 mJ/cm2 세기로 조사한 후 serum free DMEM 배지를 500 mL 첨가하고 샘플을 농도별로 첨가하였다. 24 h 동안 배양 후 배양상등액을 well plate에 4 ℃에서 코팅한다.
3 % BSA로 37 ℃ 2 h 동안 blocking하고 primary antibody (anti-human IL-6) in PBS-T를 첨가하여 37 ℃에서 90 min 동안 반응시킨다. 세척 후 secondary antibody (Goat anti-mouse IgG conjugated with peroxidase)를 첨가하고 90 min 동안 37 ℃ 반응시킨 후 TMBZ 기질용액을 첨가하여 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 측정하기 위하여 각질형성세포를 자외선 조사기로 10 mJ/cm2 세기로 조사한 후 serum free DMEM 배지를 500 μL 첨가하여 IL-6의 분비량을 측정하여 염증성 사이토카인인 IL-6에 대한 억제율을 측정하여 염증 기전에 대한 효과를 측정하였다(Figure 5).
진피 추출물의 치마버섯 배양을 통한 생물전환에 대한 확인을 위하여 HPLC로 측정하였다. Figure 1a의 경우 보존 시간을 5 min과 8 min, 10 min에서 peak를 확인할 수 있었으며, 그 이외에는 다른 피크를 확인할 수 없었으나 치마버섯의 발효배양 이후에는 추출물에서 볼 수 있었던 peak들이 모두 없어지거나 혹은 그 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었으며(Figure 1b), 오히려 추출물에 존재하지 않았던 27, 30 min의 보존 시간에서 새로운 peak가 형성됨을 확인할 수 있었다.
그 후 3 mM Linolieci acid (Sigma) 100 μL를 첨가한 후 다시 실온에서 5 min간 반응시킨다. 측정은 234 nm의 파장에서 UVspectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군은 NDGA를 사용하였다.
(UVBG15T8E, Sankyo Denki, Japan)로 조사하여 세포 내 라디칼을 생성시켰다. 프리라디칼생성 정도를 알 수 있는 형광물질(CM-DCFDA)을 처리한 후 37 ℃에서 반응시키고 FACS를 이용하여 DCF fluorescence intensity (FL-1,530 nm)를 측정하였다.
피부 세포 내 항산화효과를 측정하기 위해 섬유아세포를 60∅ plate에 분주하여 배양하고 샘플을 처리 후 4 h 뒤 자외선을 UVB 20 mJ/cm2 (UVBG15T8E, Sankyo Denki, Japan)로 조사하여 세포 내 라디칼을 생성시켰다.
활성 저해 효과 본 실험에 사용된 5-LOX 활성 저해실험은 등의 실험방법을 변형하여 이용하였다[12]. 간단히 요약하면, 0.
대상 데이터
3-(4,5-Dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), nitroblue tetrazolium (NBT), BHT, phosphate buffered saline (PBS), linoleic acid, lipoxydase(preparation type Ⅴ, from soybean), nordihydroguairetic acid (NDGA)등의 시약은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한, COX-2는 Cayman Chemical Co.
본 실험에서 사용된 진피는 건조된 것을 믹서에 분쇄시킨 후 사용되었다. 진피를 이용해 열수추출 시 용매로는 증류수를 이용하여 10 wt%의 농도로 80 ℃에서 4 h 동안 추출한 후 여액을 여과 후 받아냈다.
(USA)에서 구입 후 사용하였다. 실험에 사용된 진피(C. unshiu peel)는 제주도 (주)해이래로부터 공급을 받았으며, 치마버섯(Schizophyllum commune)은 (주)큐젠바이오텍으로부터 분양을 받아 사용하였다. 진피추출물과 진피발효물의 활성 성분을 확인하기 위하여 Waters사의 2695 system을 이용하였으며, PDA 검출기기는 동일 제조사의 996 검출기를 이용하였다.
측정은 234 nm의 파장에서 UVspectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 양성 대조군은 NDGA를 사용하였다. 측정 후 저해율(%)은 다음과 같은 식에 의해 나타내었다.
unshiu peel)는 제주도 (주)해이래로부터 공급을 받았으며, 치마버섯(Schizophyllum commune)은 (주)큐젠바이오텍으로부터 분양을 받아 사용하였다. 진피추출물과 진피발효물의 활성 성분을 확인하기 위하여 Waters사의 2695 system을 이용하였으며, PDA 검출기기는 동일 제조사의 996 검출기를 이용하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 5 % 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.
이론/모형
Xanthine/xanthine oxidase 반응에서 형성된 superoxide radical 소거효과는 nitroblue tetrazolium (NBT) 방법에 의해 측정하였다[18]. 0.
세포 실험에 대한 시료의 적정 처리농도를 결정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 간단히 요약하면, 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs)를 96 well plate에 1.
성능/효과
COX-2 저해율을 측정한 결과에서도 5-LOX와 유사한 경향을 나타내었으며, 양성 대조군인 EGCG보다는 다소 낮으나 이 역시 COX-2를 저해하는 물질이 있음을 확인할 수 있었다. 또한 배양 시간별로 보았을 경우에도 배양 시간이 증가함에 따라 저해율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 진피발효물을 통한 생물전환이 진피 추출물 내부의 활성물질을 변화시킬 수 있다는 것을 간접적으로 유추할 수 있다.
세기로 조사한 후 serum free DMEM 배지를 500 μL 첨가하여 IL-6의 분비량을 측정하여 염증성 사이토카인인 IL-6에 대한 억제율을 측정하여 염증 기전에 대한 효과를 측정하였다(Figure 5). 그 결과 진피발효물의 농도의존적으로 LI-6의 발현량이 감소함을 확인할 수 있었으며 1 mg/mL의 농도로 시료를 처리하여 측정하였을 때는 대조군과 유사한 IL-6 발현량을 나타내어 염증 발현을 감소시킬 수 있는 소재로 충분히 가능성이 있을 것으로 사료된다.
3 mg/mL이였으며, 진피추출물의 경우에는 NDGA에 비해서는 다소 낮으나 5-lipoxygenase 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 진피 발효 배양액의 배양 시간별 5-LOX 측정 결과 배양 시간이 지날수록 저해효과가 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 배양 72 h 이후부터는 저해 효과가 유사한 것으로 나타났다. 이는 배양 시간이 증가함에 따라 생물전환되어 아글리콘이 생성되어 5-LOX 저해에 영향을 주는 물질을 생성하는 것으로 사료된다.
진피추출물과 진피발효물의 NBT assay를 측정해본 결과, 양성 대조군인 녹차 추출물의 경우 1 mg/mL의 농도에서 91 %의 활성산소 제거능을 나타내었으며, 녹차추출물의 경우에는 그 활성이 매우 낮아 20 %를 약간 넘는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3). 그에 반해 치마버섯을 이용한 진피 발효추출물 10 wt%의 경우 배양 시간에 비례하여 활성산소 제거능이 점점 증가함을 확인할 수 있으며, 배양 48 h 이후에서는 80 % 이상의 우수한 활성산소 제거능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 진피발효물의 높은 항산화력을 확인할 수 있었다.
COX-2 저해율을 측정한 결과에서도 5-LOX와 유사한 경향을 나타내었으며, 양성 대조군인 EGCG보다는 다소 낮으나 이 역시 COX-2를 저해하는 물질이 있음을 확인할 수 있었다. 또한 배양 시간별로 보았을 경우에도 배양 시간이 증가함에 따라 저해율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 진피발효물을 통한 생물전환이 진피 추출물 내부의 활성물질을 변화시킬 수 있다는 것을 간접적으로 유추할 수 있다.
본 실험에서는 담자균류인 치마버섯 균사체를 이용하여 발효 배양한 결과 배양 시간이 지남에 따라 진피추출물 내 플라보노이드 배당체가 아글리콘 화합물로 생물전환 되어, 진피추출물의 미비한 항산화 및 항염증 효과를 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 진피를 한방 혹은 민간요법, 식용으로 뿐만 아니라 발효 배양을 이용하여 그 효과가 증대되므로 이를 의약이나 화장품 분야에서도 이용가능성을 높일 수 있을 것이다.
그에 반해 치마버섯을 이용한 진피 발효추출물 10 wt%의 경우 배양 시간에 비례하여 활성산소 제거능이 점점 증가함을 확인할 수 있으며, 배양 48 h 이후에서는 80 % 이상의 우수한 활성산소 제거능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 진피발효물의 높은 항산화력을 확인할 수 있었다.
진피발효물의 5-LOX 저해율을 측정한 결과, 양성 대조군인 NDGA의 IC50 값은 21.3 mg/mL이였으며, 진피추출물의 경우에는 NDGA에 비해서는 다소 낮으나 5-lipoxygenase 저해 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 진피 발효 배양액의 배양 시간별 5-LOX 측정 결과 배양 시간이 지날수록 저해효과가 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 배양 72 h 이후부터는 저해 효과가 유사한 것으로 나타났다.
진피발효물의 농도별 세포독성을 평가해본 결과 Figure 2에서 최저 농도인 0.05 mg/mL의 경우 97 % 이상의 세포 생존률을 보이며, 최대 농도인 5 mg/mL의 경우에도 80 % 이상의 세포 생존률을 보인 것을 확인할 수 있었으며, 이는 진피발효물의 안전성을 확인할 수 있는 결과이다.
진피발효물의 피부 세포 내 항산화효과를 측정하기 위해 섬유아세포를 분주하여 배양하고 샘플을 처리 후 4 h 뒤 자외선을 UVB 20 mJ/cm2로 조사하여 세포 내 라디칼을 생성한 뒤 형광 강도를 측정한 결과, 진피발효물은 대조군에 비해 매우 낮은 값을 확인할 수 있었으며, 농도의존적으로 항산화 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 4).
진피추출물과 진피발효물의 NBT assay를 측정해본 결과, 양성 대조군인 녹차 추출물의 경우 1 mg/mL의 농도에서 91 %의 활성산소 제거능을 나타내었으며, 녹차추출물의 경우에는 그 활성이 매우 낮아 20 %를 약간 넘는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3). 그에 반해 치마버섯을 이용한 진피 발효추출물 10 wt%의 경우 배양 시간에 비례하여 활성산소 제거능이 점점 증가함을 확인할 수 있으며, 배양 48 h 이후에서는 80 % 이상의 우수한 활성산소 제거능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
본 실험에서는 담자균류인 치마버섯 균사체를 이용하여 발효 배양한 결과 배양 시간이 지남에 따라 진피추출물 내 플라보노이드 배당체가 아글리콘 화합물로 생물전환 되어, 진피추출물의 미비한 항산화 및 항염증 효과를 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 진피를 한방 혹은 민간요법, 식용으로 뿐만 아니라 발효 배양을 이용하여 그 효과가 증대되므로 이를 의약이나 화장품 분야에서도 이용가능성을 높일 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한방에서 말하는 진피의 효능은?
감귤은 국내 및 동남아시아 지역에서 많이 즐기는 식품 중 하나이며, 이러한 감귤류의 껍질을 건조시킨 것을 진피라고 한다. 이러한 진피는 한방에서는 이뇨작용, 비장기능을 강화하는 것으로 알려져 있으나, 천연 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 학계에서 여러 분야로 연구가 되고 있는 실정이다. 본 연구에서는 플라보노이드 배당체를 함유한 진피 추출물을 ${\beta}$-glucosidase 효소를 이용하여 아글리콘(aglycone)으로 변환 할 수 있도록 치마버섯 배양을 실시하였다.
Cyclooxygenase-2는 어떤 반응의 촉매로 작용하는가?
피부에 햇빛으로부터 자외선이 조사되면 염증 등의 다양한 질환이 유발되며, 자외선 등의 원인 불명의 항원에 의해 세포 내 존재하는 다양한 염증유발인자들의 발현이 증가하면서 염증을 일으킨다. 대표적으로 prostaglandin(PG)생합성을 촉매하는 COX-2는 염증반응에서 중요한 매개체로 알려져 있다. Cyclooxygenase-2 (COX-2)는 발현에 의해 tumor growth factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) 등의 다양한 growth factor들의 발현에 영향을 끼친다.
진피란?
감귤은 국내 및 동남아시아 지역에서 많이 즐기는 식품 중 하나이며, 이러한 감귤류의 껍질을 건조시킨 것을 진피라고 한다. 이러한 진피는 한방에서는 이뇨작용, 비장기능을 강화하는 것으로 알려져 있으나, 천연 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 학계에서 여러 분야로 연구가 되고 있는 실정이다.
참고문헌 (13)
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