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문제 정의
- 따라서, 피부 친화적이고 안정적인 미백 소재로서 식물추출물의 기능성을 확인하여 유효물질을 찾아내는 것은 중요하다. 본 실험에서는 한국에 자생하는 쪽(Persicaria tinctoria)의 꽃 부위 미백 활성을 검증하여, 기능성 천연물질을 동정하는데 그 목적이 있다.
- 본 연구에서는 쪽 꽃 추출물의 멜라닌 생합성 저해활성에 대하여 확인하였고, 이러한 활성에 기여하는 주요 물질을 규명하였다. 주 활성물질은 쪽 꽃의 2차대사 산물 중 flavonoid 성분인 M3R과 Q3R로, 두 물질의 tyrosinase 저해활성에 대해서는 선행된 연구[Jeong과 Shim, 2004]를 통하여 보고되어 있다.
제안 방법
- C451에서 분리한 compound 1, C542에서 분리한 compound 2의 동정을 위해 기기분석을 실시하였다. 구조는 MS 분석 결과와 1H NMR spectrum 분석 결과를 종합하여 확인하였다.
- EtOAc fraction을 80% methanol (MeOH)를 용매로 사용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였고, 순수한 활성 물질을 얻기 위하여 C18 reversedphase column (YMC-Pack Pro C18, 250×4.6 mm)을 사용, HPLC를 수행하였다.
- HPLC를 이용하여 두 개의 활성부위(C45, C54)에 대한 정제를 수행하였다. HPLC를 실시하여 각각 4개의 분획물(C451~C454, C541~C544)을 얻었고, 각 분획물의 tyrosinase 저해활성을 확인한 결과 compound 1이 존재하는 C451과 compound 2가 존재하는 C542에서 비교적 높은 수준의 저해활성을 확인하였다.
-
LH-20 column chromatography 분획층에 대한 MS 분석 수행.
- 본 실험에 사용된 기기 및 기구는 다음과 같다. Microplate reader (BioTek, Winooski, VT), preparative HPLC (Hitachi Inc., Tokyo, Japan), LC-MS는 Varian 212 HPLC가 부착된 Varian 500-MS ion trap spectrometer (Palo Alto, CA), nuclear magnetic resonance (NMR)은 Brucker Avance 500 MHz spectrometer (Rheinstetten, Germany), column chromatography는 Sephadex LH-20 (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) 등을 사용하였다.
-
Tyrosinase 저해활성 측정.
- Tyrosinase 저해활성 측정을 위하여 disodium hydrogen phosphate 12-water, sodium dihydrogen phosphate dihydrate를 증류수(D.W.)에 녹여 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5)를 제조하였고, tyrosinase에 대한 반응기질로 사용하기 위하여 L-tyrosine (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 100 mM sodium phosphate buffer에 녹여 1.5 mM L-tyrosine 용액을 제조하였다. 반응 효소로 작용하는 mushroom tyrosinase (Sigma)는 100 mM sodium phosphate buffer에 녹여 2,500 units/ml의 tyrosinase를 준비하였다.
- C451에서 분리한 compound 1, C542에서 분리한 compound 2의 동정을 위해 기기분석을 실시하였다. 구조는 MS 분석 결과와 1H NMR spectrum 분석 결과를 종합하여 확인하였다. Compound 1과 2는 methanol-d4에 녹여 1H NMR spectrum을 측정하였으며, compound 1 분석결과 7.
- 에 녹이고 EtOAc, BuOH을 차례대로 가하여 분획하였다. 세 layer 중 tyrosinase에 대한 저해활성이 가장 높은 EtOAc layer를 선택, 80% MeOH를 용매로 사용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였고, 이를 통하여 얻은 100개의 분획물(C1~100)에 대해 tyrosinase 저해활성을 측정, 두 개의 활성 분획물(C45, C54)를 얻었다.
- 활성 물질의 분리를 위하여 유기용매 분획을 수행하였다. 용매 분획을 위하여 건조된 2g의 쪽 꽃 메탄올 추출물을 135 mL의 증류수에 녹이고, ethyl acetate (EtOAc), buthanol (BuOH)을 각각 270 mL씩 차례로 가하여 분획하였다. EtOAc fraction을 80% methanol (MeOH)를 용매로 사용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였고, 순수한 활성 물질을 얻기 위하여 C18 reversedphase column (YMC-Pack Pro C18, 250×4.
- 구입한 쪽의 꽃 부위 30 g을 80% MeOH을 사용, 25℃에서 3일간 추출 하여 2g의 메탄올 추출물을 얻었다. 이를 D.W.에 녹이고 EtOAc, BuOH을 차례대로 가하여 분획하였다. 세 layer 중 tyrosinase에 대한 저해활성이 가장 높은 EtOAc layer를 선택, 80% MeOH를 용매로 사용하여 Sephadex LH-20 column chromatography를 수행하였고, 이를 통하여 얻은 100개의 분획물(C1~100)에 대해 tyrosinase 저해활성을 측정, 두 개의 활성 분획물(C45, C54)를 얻었다.
- 활성 물질의 분리를 위하여 유기용매 분획을 수행하였다. 용매 분획을 위하여 건조된 2g의 쪽 꽃 메탄올 추출물을 135 mL의 증류수에 녹이고, ethyl acetate (EtOAc), buthanol (BuOH)을 각각 270 mL씩 차례로 가하여 분획하였다.
대상 데이터
- 6 mm)을 사용, HPLC를 수행하였다. Mobile phase는 5%의 acetonitrile이 포함된 water (A)와 100% acetonitrile (B)을 사용하였다. Flow rate는 1 mL/min, A용매 100-5%, B용매 0-95%로 농도에 변화를 주어 50분간 수행하였다.
- Sodium phosphate buffer 제조를 위해 disodium hydrogen phosphate 12-water (Junsei chemical, Tokyo, Japan), sodium dihydrogen phosphate dehydrate (Junsei chemical, Tokyo, Japan)를 사용했으며, mushroom tyrosinase (2,500 units/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), L-tyrosine (Sigma Chemical Co.)등을 tyrosinase 저해활성 측정에 사용하였다. 시료의 추출을 위하여 methanol (Duksan chemical Co.
- 본 실험에서 사용한 쪽은 메탄올 추출물 상태로 농촌진흥청에서 제공 받았으며, 후속 실험을 위해 추가로 구매(전라도 광주에서 채취)하여 실험을 수행하였다.
- 시료의 추출을 위하여 methanol (Duksan chemical Co., Seoul, Korea), 분획에 사용된 용매로 ethyl acetate (Duksan chemical Co.), butanol (Duksan chemical Co.), HPLC, LC-MS용매로 acetonitrile (Burdick&Jackson, Muskegan, MI), water (Burdick&Jackson), formic acid (Sigma chemical Co.), NMR용매는 methanol-d4 (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA)를 사용하였다.
성능/효과
- 200 µg/mL, 100µg/mL 그리고 50 µg/mL으로 농도별로 처리했을 때 tyrosinase 활성이 무처리군인 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 유의적 억제를 나타내었다.
- C451에서의 IC50의 농도는 150.5 µg/mL, C542는 47.0 µg/mL를 보였으며, MS 분석을 통하여 compound 1은 분자량 464, compound 2는 분자량 448로 확인되었다 (Table 1).
- HPLC를 이용하여 두 개의 활성부위(C45, C54)에 대한 정제를 수행하였다. HPLC를 실시하여 각각 4개의 분획물(C451~C454, C541~C544)을 얻었고, 각 분획물의 tyrosinase 저해활성을 확인한 결과 compound 1이 존재하는 C451과 compound 2가 존재하는 C542에서 비교적 높은 수준의 저해활성을 확인하였다. C451에서의 IC50의 농도는 150.
- 그 결과 tyrosinase를 50% 억제할 수 있는 농도(IC50)는 150.5±1.6 µg/mL로 확인하였다.
- 그 결과 tyrosinase를 50% 저해할 수 있는 농도(50% inhibitory concentration, IC50)는 70.8 µg/mL로 확인할 수 있었다.
후속연구
- 그러므로, M3R과 Q3R을 함유하고 있는 쪽 꽃 추출물에서도 위와 같은 생리활성을 기대할 수 있을 것으로 예상된다. M3R과 Q3R이 동물세포 내 멜라닌 생성에 미치는 상관관계는 아직 보고되지 않았으며, 향후 세포 및 유전자 수준에서의 후속 실험을 진행하여 두 활성물질의 작용 기전을 밝혀내기 위한 연구를 진행할 예정이다.
- 쪽 꽃 유래 화합물은 tyrosinase에 대한 저해활성을 나타내며, 본 연구에서 이를 확인함으로써 이미 활성이 보고된 잎 부위와 더불어 천연 미백물질로서의 이용가능성을 넓힐 수 있을 것으로 사료된다.
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