[논문]과산화수소로 유도된 산화성 간세포 손상에 대한 소시호탕(小柴胡湯)의 효과

서상희; 오수영; 이지선; 조원경; 김태수; 마진열

[국내논문] 과산화수소로 유도된 산화성 간세포 손상에 대한 소시호탕(小柴胡湯)의 효과
Effects of Soshiho-tang on Hydrogen Peroxide-induced Oxidative Damage in Hepatocytes 원문보기

대한한방내과학회지 = The journal of internal Korean medicine, v.32 no.4, 2011년, pp.487 - 496

서상희 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 오수영 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 이지선 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 조원경 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 김태수 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 마진열 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The aim of this study was to investigate the hepatoprotective effect of Soshiho-tang (SSH) in mouse primary liver cells against hydrogen peroxide ($H_2O_2$)-induced oxidative stress. We also elucidated the molecular mechanism of hepatoprotective effect by SSH. Methods : Cell viability, level of ALT, AST and LDH, intracellular ROS level, mRNA expression and activity of antioxidant enzymes were used to evaluate hepatoprotection of SSH against $H_2O_2$. Target gene expressions were analyzed by real-time PCR. Results : Pre-treatment with SSH for 1 hour prevented cytotoxicity against $H_2O_2$. $H_2O_2$-induced ROS level decreased under SSH pre-treatment. mRNA expression of GPx and SOD increased in SSH-treated cells. In addition, HSP72 and HSP40 gene expression were elevated under SSH-treatment. Conclusions : These results indicate that SSH protects mouse primary liver cells from $H_2O_2$-induced oxidative injury. This hepatoprotective activity of SSH is mediated by decreasing intracellular ROS and increasing antioxidant enzyme expression (GPx and SOD) and stress response protein (HSP72 and HSP40).

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

그러나 H₂O₂에 대한 소시호탕의 간 보호 효능에 대한 연구는 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 활성산소인 H₂O₂에 대한 간 독성을 억제하는 소시호탕의 효능을 확인하고, 이들의 간 보호 효능에 관여하는 분자메카니즘을 규명하였고, 이를 보고하고자 한다.
이들 HSPs는 허혈 손상, 과열, 흥분성 손상, 중금속, 그리고 약물 노출 등 스트레스에 대한 반응으로 발현되는 것으로 알려져 있다²². 본 연구에서는 H₂O₂로 인한 간독성에서 소시호탕 물추출물의 간보호 효능에 HSPs 유전자의 관련성을 확인하였다. 마우스 일차 간세포에 소시호탕 물추출물을 1시간 동안 전 처리 한 후, H₂O₂를 6 시간동안 처리하였다.
본 연구에서는 소시호탕 물추출물의 활성산소 순화 효능 뿐 만 아니라 세포내 항산화 효소의 활성변화도 관찰하였다. 산소를 이용하는 생물체는 superoxide를 제거하는 효소인 SOD를 가지고 있어 superoxide radical을 H₂O₂로 전환시키고 그때 생성된 H₂O₂는 catalase와 GSH-Px에 의해 H₂O와 O로 분해하여 무독화시켜 체외로 배출시킨다.
HSP40은 DnaJ로도 불리기도 하는데, HSP70과 함께 세포내에서 chaperone 기능을 수행하는 것으로 알려져 있고²⁶, HSP27는 특히 apoptosis를 억제하는 등 세포자멸사 신호전달에도 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다²⁷. 본 연구에서는 소시호탕에 대한 간 보호 효과에 이들 HSPs 유전자의 관련성을 확인하였다. 그 결과, HSP72와 HSP40의 경우, 소시호탕 전 처리한 실험군에서 증가되었으나, HSP27의 경우 오히려 소시호탕 처리에 의해 감소되었다.
그러나 H₂O₂에 의한 산화성 간세포 손상에 대한 소시호탕의 영향에 관한 연구는 이루어져있지 않았다. 이에 본 연구에서는 H₂O₂에 의한 산화성 간세포 손상 모델을 이용하여 소시호탕의 간보호 효과를 확인하였다.

제안 방법

ALT, AST 및 LDH의 측정은 간세포의 배양액을 취하여 측정하였다. ALT, AST의 활성은 ChemiLab ALT and AST assay kits(IVD Lab Co.
H₂O₂로 유발되는 간세포의 독성이 소시호탕 물추출물을 전처리함으로써 감소되는지 확인하였다. 마우스의 일차 간세포에 소시호탕 물추출물 200 ㎍/㎖을 1 시간동안 전처리한 후 H₂O₂를 6 시간동안 처리하였고, 세포 배양액을 수거하여 간세포 독성 및 세포독성의 지표인 ALT, AST 및 LDH의 양을 조사하였다(Fig.
H₂O₂에 의한 세포 독성이 소시호탕의 전처리에 의해 감소되는지 MTT assay 방법으로 세포생장률을 확인하였다. 소시호탕 물추출물을 농도별로 1시간동안 마우스의 일차 간세포에 전처리 한 후 H₂O₂ 1 mM를 24 시간동안 처리하였다.
40%으로 통계적으로 유의한 세포생장률의 증가가 보였다. MTT 결과 세포생장률을 증가시키는 소시호탕의 적정 농도를 200 ㎍/㎖이라 판단하여 이후 진행된 실험에서 소시호탕의 농도를 200 ㎍/㎖으로 전 처리하여 실험을 진행하였다.
Total RNA를 easy-spin™ Total RNA Extraction Kit(intron)을 이용하여 분리한 후, Qiagen Omniscript RT kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
또한 H₂O₂에 의한 세포사멸이 소시호탕 물추출물의 전처리에 의해 억제되는지 확인하기 위하여 DNA fragmentation을 진행하였다(Fig. 2). 소시호탕 물추출물을 1 시간 전 처리 한 후 1 mM의 H₂O₂를 24 시간동안 처리하여 genomic DNA를 확보하고 전기영동 한 결과, 소시호탕 물추출물을 전 처리한 시료의 DNA fragmentation이 H₂O₂ 단독 처리한 시료에 비해 현저히 감소되었음을 확인하였다.
을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스에 졸레틸과 럼푼을 복강 내로 주사하여 마취한 후 개복하였으며, 간문맥에 24 gauge catheter를 삽관하여 Krebs-Ringer-HEPES 완충용액으로 관류시키고 collagenase(sigma, USA)로 구성된 소화용액을 순환 시켰다. 간막을 벗겨 간세포가 유리한 후 nylon mesh를 사용하여 여과한 후, 여과액을 원심분리하여 간세포를 침전시켰다.
마우스의 일차 간세포 내 ROS 양은 형광 probe인 DCF-DA을 사용하여 측정하였다. 배양액에 2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA)(Invitrogen) 용액을 첨가하여 30 분간 처리하였다.
로 유발되는 간세포의 독성이 소시호탕 물추출물을 전처리함으로써 감소되는지 확인하였다. 마우스의 일차 간세포에 소시호탕 물추출물 200 ㎍/㎖을 1 시간동안 전처리한 후 H₂O₂를 6 시간동안 처리하였고, 세포 배양액을 수거하여 간세포 독성 및 세포독성의 지표인 ALT, AST 및 LDH의 양을 조사하였다(Fig. 3). ALT는 정상군(5.
배양액에 2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA)(Invitrogen) 용액을 첨가하여 30 분간 처리하였다.
시호, 황금, 인삼, 반하, 대추는 영천현대약업사(경북 영천시 완산동 925-15)에서 구입하였으며, 감초는 미륭생약(경북 영천시 금노동 377-26)에서, 생강은 농협에서 각각 생산자 및 재배지역이 명확한 한약재를 구입하였다. 본 연구에서는 전탕추출법(한국, 경서추출기 Cosmos-660)에 의한 시험물질 조제를 실시하였으며 각 한약재들은 16.7 L의 생수(화이트, 경남 산청군 삼장면 덕교리 800)에 1 시간 동안 침적시킨 다음 180 분간 열탕 추출하였고, 동결건조기(한국, 일신 FD5512)를 사용하여 분말 형태로 조제하였다(수율: 24.89%).
소시호탕 물추출물 200 ㎍/㎖을 1 시간 동안 전처리 한 후 세포에 H2O2 1 mM로 처리하고 24 시간 배양 후 Wizard® Genomic DNA Purification Kit(promega)를 이용하여 genomic DNA를 확보하였다.
소시호탕 물추출물에 의한 세포내 활성산소의 생성 억제효과를 확인하기 위하여 마우스의 일차 간세포에 소시호탕 물추출물 200 ㎍/㎖을 전처리한 후 H₂O₂를 4 시간 동안 처리하였고 FACS를 이용하여 세포내 활성산소의 발생량을 측정하였다. 그 결과, H₂O₂에 의해 유발되는 활성산소가 소시호탕 물추출물의 전처리에 의해 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig.
소시호탕 물추출물에 의해 항산화제 효소의 활성이 조절되는지 확인하기 위하여, 이들 효소의 활성을 관찰하였다(Fig. 6). 소시호탕 물추출물을 1시간 동안 처리 한 후 H₂O₂를 1 mM 처리하고 6시간동안 배양하였다.
에 의한 세포 독성이 소시호탕의 전처리에 의해 감소되는지 MTT assay 방법으로 세포생장률을 확인하였다. 소시호탕 물추출물을 농도별로 1시간동안 마우스의 일차 간세포에 전처리 한 후 H₂O₂ 1 mM를 24 시간동안 처리하였다. Fig.
소시호탕 물추출물이 H₂O₂에 의한 활성산소의 억제와 함께 항산화제 효소의 발현을 조절하는지 확인하기 위하여, real-time PCR 방법으로 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GPx) 및 catalase(CAT) 유전자 발현을 확인하였다. 마우스 일차 간세포에 소시호탕 물추출물을 1 시간동안 전 처리 후 H₂O₂를 6 시간동안 처리한 후 total RNA를 분리하였다.
배양액에 2’,7’-Dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA)(Invitrogen) 용액을 첨가하여 30 분간 처리하였다. 트립신이 처리된 세포를 수거하여 PBS로 현탁한 후 이를 fluorescence-activated cell sorting(BD Immunocytometry Systems)를 사용하여 세포내 ROS와 반응한 형광정도를 측정하였다.
프라이머 (actin-F, tggaatcctgtggcatccatgaaa; actin-R, taaaacgcagctcagtaacagtccg; CAT-F, ctcggtttcccgtgcaatcag; CAT-R, gtgcagccagtaatcaccaag; SOD-F, ggacctcattttaatcctcactctaag; SOD-R, tgcccaggtctccaacatg; GPx-F, tctgcagatacctgtgaactg; GPx-R, tagtcagggtggacgtcagtg; HSP72-F, accaacgacaagggccgcct; HSP72-R, acttgtccagcaccttcttc; HSP40-F, ttacaaggcgaggagaagac; HSP40-R, ttgacaatctgacctggatg; HSP27-F, tgcttcacccggaaatacac; HSP27-R, ctcgaaagtaaccggaatgg)를 사용하여 94 ℃ 10 분, [94 ℃ (10 초), 50 ℃ (20 초), 72 ℃ (30 초)] * 40 cycles 분의 조건으로 real-time PCR(Eco™ Real-Time PCR System, Illumina)을 진행하였다.

대상 데이터

배양액은 10% FBS(Hyclone), 500 U/ℓ insulin(Roche, Switzerland), 2 mM L-glutamine(Lonza), 15 mM HEPES(Lonza, Switzerland), 105 U/ℓ penicillin, 100 mg/ℓ streptomycin(Gibco, USA)를 포함하는 William's E media(Gibco)를 사용하였으며, 일정한 온도와 습도가 유지되는 37 ℃ 배양기에서 CO2 5%의 혼합기체를 공급하여 배양하였다.
본 실험에서 사용한 소시호탕의 처방 구성은 Table 1과 같다. 시호, 황금, 인삼, 반하, 대추는 영천현대약업사(경북 영천시 완산동 925-15)에서 구입하였으며, 감초는 미륭생약(경북 영천시 금노동 377-26)에서, 생강은 농협에서 각각 생산자 및 재배지역이 명확한 한약재를 구입하였다. 본 연구에서는 전탕추출법(한국, 경서추출기 Cosmos-660)에 의한 시험물질 조제를 실시하였으며 각 한약재들은 16.
체중이 30±3 g의 수컷 ICR 마우스(오리엔트 바이오, 경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1) 5주령을 사용하였으며, 일주일간 시험을 실시하는 동물실에서 순화시키고 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 사용하였다.

데이터처리

실험결과는 SPSS package program(version 12.0)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며 실험군 간의 차이의 유의성은 one-way ANOVA(analysis of variance)와 Dunnet test에 의하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.

이론/모형

ALT, AST 및 LDH의 측정은 간세포의 배양액을 취하여 측정하였다. ALT, AST의 활성은 ChemiLab ALT and AST assay kits(IVD Lab Co. Ltd. Korea)를 사용하여 제공된 시험방법에 준하여 측정하였고, LDH는 Cytotoxicity detection kit(Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 사용하여 Colorimetric assay 방법으로 측정하였다.
항산화제 효소 활성 측정은 Catalase Activity Assay Kit(K762-100, 바이오비젼), Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay Kit(K33-100, 바이오비젼) 및 Glutathione Peroxidase Activity Assay Kit (K773-100, 바이오비젼)를 사용하여 바이오비젼에서 제시한 방법에 준하여 측정하였다.

성능/효과

ALT는 정상군(5.24±0.57)에 비해 H2O2의 처리에 의해 83.26±0.13(10 %)으로 증가하였으나 소시호탕의 전처리에 의해서 21.99±0.04(26.42±0.053%)로 유의성 있게 회복되었고, AST 역시 정상군(6.57±0.48)에 비해 H2O2의 처리로 53.11±0.75(10 %)으로 증가하였으나 소시호탕의 전처리에 의해 17.98±0.18(3 .86±0.3 %)로 현저하게 감소되었다.
반면, 소시호탕 물추출물에 의한 항산화제 효소 활성을 실험한 결과, GPx의 활성은 유전자의 발현 양상과 비슷하게 소시호탕을 처리하였을 때 증가하는 패턴을 보이지만 유의성은 없었다. CAT 역시 real-time PCR 결과와 마찬가지로 소시호탕 처리에 의해 약간 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었고, SOD의 경우는 소시호탕 물추출물에 의한 활성변화를 확인할 수 없었다.
Fig. 1에서 보이는 것과 같이 H2O2 단독 처리군의 경우, 약 40%의 생장률을 보이지만 소시호탕 물추출물을 전처리하였을 경우 100 ㎍/㎖의 농도에서 93.19±5.18%, 300 ㎍/㎖의 농도에서 99.38±4.61%, 1000㎍/㎖의 농도에서 91.23±3.40%으로 통계적으로 유의한 세포생장률의 증가가 보였다.
를 4 시간 동안 처리하였고 FACS를 이용하여 세포내 활성산소의 발생량을 측정하였다. 그 결과, H₂O₂에 의해 유발되는 활성산소가 소시호탕 물추출물의 전처리에 의해 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).
본 연구에서는 소시호탕에 대한 간 보호 효과에 이들 HSPs 유전자의 관련성을 확인하였다. 그 결과, HSP72와 HSP40의 경우, 소시호탕 전 처리한 실험군에서 증가되었으나, HSP27의 경우 오히려 소시호탕 처리에 의해 감소되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 소시호탕에 의해 HSP27, HSP40 및 HSP72 유전자의 관련성을 추측 할 수 있고, 명확한 기전을 규명하기 위하여 추후 실험이 필요할 것으로 판단된다.
그러나 SOD 유전자의 경우 정상군(1.00±0.00)과 비교했을 때 H2O2의 처리로 SOD와 GPx 유전자 발현량은 각각 0.83±0.19, 1.37±0.06으로 변화하였고, 소시호탕의 전처리에 의해 1.84±0.07, 1.97±0.02로 현저히 증가됨을 확인하였다(Fig. 5).
분리한 RNA에서 확보한 cDNA로 real-time PCR을 진행한 결과, HSP40 및 HSP72의 유전자 발현이 소시호탕 물추출물의 전처리 실험군에서 증가됨을 알 수 있었다. 반면, H₂O₂에 의해 증가된 HSP27 mRNA level은 소시호탕에 의해 유의하게 감소됨을 확인하였다(Fig. 7).
이러한 세포내 항산화 효소의 활성을 real-time PCR로 확인한 결과, SOD와 CAT의 경우 유의성 있는 변화를 보이지 않았으나, GPx의 경우 소시호탕 물추출물의 전처리로 인하여 H₂O₂ 처리 실험군에 비해 유의성 있는 증가를 확인하였다. 반면, 소시호탕 물추출물에 의한 항산화제 효소 활성을 실험한 결과, GPx의 활성은 유전자의 발현 양상과 비슷하게 소시호탕을 처리하였을 때 증가하는 패턴을 보이지만 유의성은 없었다. CAT 역시 real-time PCR 결과와 마찬가지로 소시호탕 처리에 의해 약간 감소하는 경향은 보이나 유의성은 없었고, SOD의 경우는 소시호탕 물추출물에 의한 활성변화를 확인할 수 없었다.
본 연구에서 세포독성 비교를 위하여 ALT와 AST를 확인한 결과, H2O2를 단독으로 처리한 경우(100%)에 비해, 소시호탕을 전 처리한 경우 ALT는 26.42±0.053%, AST는 33.86±0.3 %로 현저하게 감소하였다.
마우스 일차 간세포에 소시호탕 물추출물을 1시간 동안 전 처리 한 후, H₂O₂를 6 시간동안 처리하였다. 분리한 RNA에서 확보한 cDNA로 real-time PCR을 진행한 결과, HSP40 및 HSP72의 유전자 발현이 소시호탕 물추출물의 전처리 실험군에서 증가됨을 알 수 있었다. 반면, H₂O₂에 의해 증가된 HSP27 mRNA level은 소시호탕에 의해 유의하게 감소됨을 확인하였다(Fig.
2). 소시호탕 물추출물을 1 시간 전 처리 한 후 1 mM의 H₂O₂를 24 시간동안 처리하여 genomic DNA를 확보하고 전기영동 한 결과, 소시호탕 물추출물을 전 처리한 시료의 DNA fragmentation이 H₂O₂ 단독 처리한 시료에 비해 현저히 감소되었음을 확인하였다.
소시호탕 물추출물의 항산화 효능은 FACS analysis를 이용하여 확인하였으며 H₂O₂에 의한 세포내 활성산소 증가가 소시호탕 물추출물 전처리로 인하여 현저히 감소됨을 알 수 있었다.
실험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다.
이러한 MTT formazan의 흡광도는 570 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다. 이 방법을 이용하여 소시호탕의 전처리로 인해 세포의 생장률이 높아짐을 확인하였다.
GST 또한 catalase와 유사한 기능을 수행하는 효소로 간세포의 원형질에 주로 존재하며 친전자적 중심을 가지고 있으며, 지방에 친화적인 생체이물(xenobiotic)과 내부에서 생산된 독성 물질들을 환원된 glutathione과 결합시키는 효소이다²⁴. 이러한 세포내 항산화 효소의 활성을 real-time PCR로 확인한 결과, SOD와 CAT의 경우 유의성 있는 변화를 보이지 않았으나, GPx의 경우 소시호탕 물추출물의 전처리로 인하여 H₂O₂ 처리 실험군에 비해 유의성 있는 증가를 확인하였다. 반면, 소시호탕 물추출물에 의한 항산화제 효소 활성을 실험한 결과, GPx의 활성은 유전자의 발현 양상과 비슷하게 소시호탕을 처리하였을 때 증가하는 패턴을 보이지만 유의성은 없었다.
이를 이용하여 cDNA를 제작하고, real-time PCR을 진행한 결과, CAT의 경우 정상군(1.00±0.0)에 비해 H2O2 처리로 1.17±0.08으로 증가하였고 이는 소시호탕의 전처리에 의해서 0.84±0.02로 감소되는 경향을 보였지만 유의성은 없었다.
이와 함께, LDH assay는 대개 조직손상이나 세포 손상 측정에 사용되는데, H2O2 처리에 의해 LDH활성도는 239.24±18.16(10 %)으로 정상군(18.82±1.19)과 비교했을 때 현저히 증가하였는데, 이는 소시호탕 전처리에 의해 128.83±0.93(53.85±0.39%)로 유의성 있게 감소되었다.

후속연구

그 결과, HSP72와 HSP40의 경우, 소시호탕 전 처리한 실험군에서 증가되었으나, HSP27의 경우 오히려 소시호탕 처리에 의해 감소되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 소시호탕에 의해 HSP27, HSP40 및 HSP72 유전자의 관련성을 추측 할 수 있고, 명확한 기전을 규명하기 위하여 추후 실험이 필요할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	소시호탕이란?	소시호탕(小柴胡湯)은 한국, 중국 그리고 일본에서 만성간질환, 특히 만성감염과 간경변증 환자의 치료를 위해서 사용되는 대표적인 한방처방이다1-3. 또한 소시호탕은 항염증4, 항산화5, 면역조절6,간보호7, 간재생8, 그리고 항암효과9등의 다양한 약리작용을 보인다10.
	ICR 마우스의 실험기간 동안의 사육환경은 어떠했는가?	체중이 30±3 g의 수컷 ICR 마우스(오리엔트 바이오, 경기도 성남시 중원구 상대원동 143-1) 5주령을 사용하였으며, 일주일간 시험을 실시하는 동물실에서 순화시키고 일반 임상증상을 관찰하여 건강한 동물을 사용하였다. 실험은 실험동물윤리위원회의 승인을 거쳐 이루어졌으며, 순화 및 실험기간 동안의 사육환경은 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10%, 환기횟수는 시간당 12～16회, 조명은 12시간 명암주기(점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150～300 Lx로 조정하여 일정한 사육환경 조건을 유지하였다. 그리고 실험동물용 고형사료(PMI nutrition, USA)와 물은 자유 섭취 조건으로 하였다.
	소시호탕의 처방내용은?	소시호탕의 처방내용은 시호, 황금, 인삼, 반하, 감초, 생강, 그리고 대추의 7가지 한약재이다. 이중 시호는 간 기능을 강화하여 간 장애의 치료제로 사용되며 acetaminophen으로 유도된 간 손상 흰쥐에서의 개선효과가 보고된바 있다11.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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